实验三、叶绿素含量的测定等.ppt

要求： 2、问答题： （1 ）Lambert-Beer定律又叫什么定律？列出其数学表达式（并说明各符号的代表意义）。 Lambert-Beer 定律中的比例系数“K ”的物理意义是 ……？ Lambert-Beer 定律本身是否有局限性？何谓吸光度的加和性？ （2 ）叶绿素在兰光区的吸收峰高于红光区的吸收峰,为何不用兰光区的光吸收来测定叶绿素的含量？ （3）本实验为什么要用光路宽度为1cm的比色杯？ 二、原理 叶绿素提取液中同时含有叶绿素a 和叶绿素b,二者的吸收光谱虽有不同, 但又存在着明显的重叠（如图）,在不 分离叶绿素a和叶绿素b的情况下同时测 定叶绿素a和叶绿素b的浓度,可分别测 定在665nm和649nm的光吸收, 由于在 该波长时叶绿素a、b的比吸收系数K为 已知，我们即可以根据Lambert-Beer 定律,列出浓度C与光密度D之间的关系 式： D665=83.31Ca+18.60Cb……….(1) D649=24.54Ca+44.24Cb……….(2) 从而计算出提取液中叶绿素a和叶绿素b 的浓度. 解方程式(1)(2)，则得： Ca=13.7 D665—5.76D649 ………(3) Cb=25.8 D649—7.6 D665………..(4) G总=Ca+Cb=6.10D665+20.04D649………(5) 二、材料：　　大红花老叶和嫩叶 三、实验步骤 1. 取新鲜大红花叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。 2. 称取剪碎的新鲜样品0.5g，放入研钵中，加少量碳酸钙和石英砂及2～3ml95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，暗处静置3～5min。 3. 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。 4. 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。 5. 把叶绿体色素提取液稀释5倍后倒入光径1cm的比色杯内。以95％乙醇为参比，在波长665nm、649nm下测定光密度。 四、实验结果计算 将测定得到的吸光值代入下面的式子： Ca=13.7 D665—5.76D649 ………(3) Cb=25.8 D649—7.6 D665………..(4) G总=Ca+Cb=6.10D665+20.04D649………(5) 分别计算叶绿素a、b和总叶绿素的含量 Chl（mg/g.FW）= 一 分光光度计的工作原理： 分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。 二 分光光度计的基本常识： 1、紫外光分光光度计，其使用波长在190－400nm,可见光分光光度计，其使用波长在400－800nm。 2 消光系数：是溶液对光吸收的比例常数，指在一定的浓度和波长等条件下物质的光吸收值，用K表示。它取决于溶质性质、入射光波长和温度。 消光度（也叫光密度OD，或吸光值A）：表示溶液吸收光的强弱或吸收程度，也用E表示。E值愈大，溶液对光吸收的程度愈大。 透光率（用T表示） ：是透射光强度（透过比色皿）与入射射光强度（还未过比色皿之前的光强度）之比（用T =It /I0表示） 。 三、 分光光度计的基本维护及使用注意事项： 1 分光光度计必须放置在固定且不受震动的仪器台上，不能随意搬动。严防震动、潮湿和强光直射。 2 分光光度计内放有硅胶干燥袋应定期更换。 3 仪器连续使用时间不应超过2小时，每次使用需歇半小时以上才能再用。用完仪器后，务必关避电源开关，拔下插头。清理仪器上的杂物（包括灰尘、水啧、溶液等）。 4 千万不可用手、滤纸、毛刷等物摩擦比色杯的光滑面。不允许用酒精、汽油、乙醚等有机溶液擦洗仪器。 5 盛待液时，必须达到比色杯的2/3左右，不宜过多。用完比色杯后应立即用自来水冲洗，再用蒸馏水洗净。 6 每套分光光度计上的比色杯及比色槽不得随意更换。 7 测定某未知待测液时，先制作该溶液的吸收光谱曲线，再选择最大峰的波长作为测定的波长。一般所制成的溶液应尽量使光密值在0.1－0.7的范围内测定。　 VIS-723N可见分光光度计 比色皿校正和多波长测定 操作步骤： 1.在主菜单下选择“2　光度测量” AM-300手持式叶面积仪测定叶面积 植物叶面积的测定（画纸称重法） 　　将所测叶片放在厚度均匀的称量纸上，用铅笔将叶形画好，剪下所画的纸叶，在电子天平上称重，记为W1；另取10*10c