实验九、十酶联免疫吸附试验27.ppt

实验九 酶联免疫吸附试验-ELISA实验十 IgG的分离和纯化 程 燕 2014年6月9日 实验九 酶联免疫吸附试（ Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 实验目的 1.掌握酶联免疫吸附试验的原理、种类和用途。 2.学习用酶联免疫吸附试验双抗体夹心法检测乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的方法。 3.了解HBsAg阳性的意义。 实验原理 用酶来标记抗原或抗体的免疫分析分析技术。由于酶的高效生物催化作用，产生了放大作用，使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来，这种技术被称为酶联免疫吸附试验法。 实验原理 将已知抗体（或抗原）结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性。 测定时将待检标本和酶标抗体（或酶标抗原）按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体（或抗原）发生反应，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离物成分，然后加入底物显色，进行定性或定量测定。 实验原理 ELISA的基本原理有三条：? （1）抗原或抗体能以物理性（疏水性）地吸附于固相载体表面，并保持其免疫学活性； （2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； （3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。 ? 实验原理 常用酶联免疫吸附试验有 间接法 竞争法 双抗体夹心法 ELISA-间接法 此法是检测抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体上，加入待测血清(抗体)与之结合，洗涤后，加酶标抗体和底物进行测定。其原理见图。 酶标抗体 固相抗原 待测抗体 E E E ELISA间接法示意图 底物 用于抗原及半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。 以测定抗原为例，将特异性抗体吸附于固相载体上，加入待测抗原和一定量的已知酶标抗原，使二者竞争地与固相抗体结合，经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。 固相抗体 E E E 酶标抗原待测抗原 E 底物 E 显色反应（弱） 固相抗体 E E E 酶标抗原 底物 显色反应（强） E E E E E E ELISA-竞争法 ELISA-双抗体夹心法 双抗体夹心法常用于检测抗原。 将已知抗体吸附于固相载体，加入待测标本(含相应抗原)与之结合，温育后洗涤，加入酶标抗体及底物溶液进行测定。 酶标抗体 固相抗体 待测抗原 E E E 双抗体夹心法检测抗原 实验材料 1、乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒 定性检测人血清或血浆中的乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg。 包括： HBsAg特异性抗体（一抗）已包被于酶标板上 HBsAg阴、阳性血清各1份、 酶标抗体（二抗）1份， 显色剂A、B各1份，终止液1份，洗涤液1份， 2、待检血清5份 3、微量加样器（10-100ul）及匹配的枪头 4、废液缸 注意：有污染性。 夹心法检测HBsAg方法 由于抗体1已包被在酶标板上，故直接从加抗原开始。 1、加样：每组2条8孔，待检8孔，阴性对照、阳性对照、空白对照各1孔。分别加75ul待测样本和阴、阳性对照于相应孔内，盖封板膜，置37℃恒温箱温育60分钟。2、加酶标抗体： 除空白对照孔外，每孔加1滴酶标溶液，混匀后封板， 置37℃水浴箱温育30分钟。3、洗涤： 用洗涤液（按说明配制）注满各孔，静置20秒，甩去洗涤液，重复4次，最后一次在吸水纸上拍干。4、显色： 每孔加底物液A 、B 各1滴（50ul），轻拍混匀，置37℃避光显色30分钟，肉眼观察。5、终止：每孔加终止液1滴（50ul），轻拍混匀。在10分钟内酶标6、测定：用酶标仪（波长450nm）测定各孔吸光度OD值。 酶：辣根过氧化物酶(HRP) 底物：3,3‘,5,5’-四甲基联苯胺（TMB） 在辣根过氧化物酶催化下，TMB会产生可溶性蓝色产物。使用2M ?H2SO4终止反应，在450nm测定吸光度。 结果判断  1、定性：夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。 2、P/N值≥2.1者判为HBsAg阳性；P/N值＜2.1者判为阴性。介于中间为可疑。 S：待测样本OD值 COV： cut-off value =NCx+0.100 NCx：阴性对照OD值的均值 阳性判定值=S/COV ≧1.0：阳性 ﹤1.0：阴性 实验报告 1、计算5个待测样本的S/COV，判断结果 2、本实验中采用的酶、底物及反应原理。 实验十 IgG的分离和纯化 实验目的 实践IgG分离纯化过程 了解分离、纯化抗体的原理 比较