实验二微量凯氏定氮法测定.ppt

实验二 微量凯氏定氮法测定蛋白质含量 实验目的 学习微量凯氏定氮法的原理 掌握微量凯氏定氮法的操作技术（未知样品的消化、蒸馏、滴定及其含氮量的计算等） 实验原理 凯氏定氮法常用于测定天然有机物（如蛋白质，核酸及氨基酸等）的含氮量。 当天然含氮有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢被氧化成二氧化碳和水，而氮则变成氨并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程称为“消化”。 此过程进行的相对较为缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。氧化剂过氧化氢也能加速反应。 蒸馏：在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式如下：  吸收与滴定：蒸馏所放出的氨，可用硼酸溶液进行吸收，待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止（即滴定至蓝紫色)，最后根据所用标准酸的当量数（相当于待测物中氨的当量数）计算出待测物中的氮量。 实验材料与试剂 实验材料：食用面粉 实验试剂： 浓硫酸 30%氢氧化钠溶液 克氏催化剂 2%硼酸 指示剂 0.01M HCL 实验器材 凯氏烧瓶 电炉 凯氏定氮蒸馏装置 锥形瓶 100ml容量瓶 酸式滴定管 操作步骤 消化： 准确称取1克食用面粉，用称量纸卷好小心送入至50毫升的凯氏烧瓶底部，切勿沾于瓶口或瓶颈上。向另一烧瓶加入1ml水作空白对照。 在每个烧瓶内加入硫酸钾—硫酸铜混合物（克氏催化剂）少许，浓硫酸10ml，小瓷片两粒，摇匀。将烧瓶约60度角固定在铁架上，每个瓶口放一小漏斗，在通风厨内的电炉上消化。 在消化开始时，应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明绿色为止。消化完毕，待烧瓶内容物冷却后，加蒸馏水10ml（注意慢加，边加边摇）。冷却后将瓶内容物转入100ml的容量瓶中，并用蒸馏水洗烧瓶数次，溶液一并倒入容量瓶，最后定容至刻度摇匀，做上记号备用。 蒸馏： 仪器的洗涤： 蒸馏器洗净后，开放水龙头P3，使水进入A室，水放至A室球部即可。 取3个50ml的锥形瓶，各准确加入10ml硼酸（内加有混合指示剂）。用表面皿复盖备用。 A、加样：用吸量管吸取2ml消化液，细心地由漏斗D倾入蒸馏室，再用蒸馏水1毫升清洗漏斗。取一个盛有硼酸—混合指示剂的锥形瓶，置于M管下，使管口恰好接触硼酸溶液，用量筒从漏斗D加入30%氢氧化钠5ml，随即将P4夹紧，并往漏斗加入少量蒸馏水封闭。 B、蒸馏：用酒精灯加热（应用挡风板将灯围拢，维持火力恒定，沸腾不可高于Y管口以免A室溶液从Y管倒吸，待第一滴蒸馏液从冷凝柱F顶端滴下时起，继续蒸3-5分钟，然后将锥形瓶放低，使导管离开液面再蒸2分钟，最后用蒸馏水洗导管外壁，蒸馏完毕，取下锥形瓶，随即将蒸馏器洗净。） C、样品及空白蒸馏：用吸量管分别吸取2ml样品和2ml空白按上述操作步骤进行蒸馏。 滴定： 蒸馏完毕，用微量酸式滴定管，以0.01mol/L 盐酸标准溶液进行滴定锥瓶内溶液，溶液由蓝绿色变为淡紫色或灰色，即为终点。记录所用盐酸的量。 计算： 若测定的样品含氮量部分只是蛋白质则： 样品的总蛋白含量（克蛋白%）= 式中：A为滴定样品用去的盐酸平均毫升数； B为滴定空白用去的盐酸平均毫升数； C为称量样品的克数：0.0100为盐酸的当量浓度（实际上，此项应按实验中使用盐酸的实际浓度填写）； 14为氮的原子量； 6.25为常数（1毫升0.1N盐酸相当于0.14毫克氮）。 注意事项 本法适用于0.05-3.0mg氮，样品中含氮量过高时，则应减少取样量或将样液稀释。 勿使样品粘于烧瓶颈部。放置液体样品时，需将吸管插至烧瓶底部再放样：如固体样品，可将样品卷在纸内，平插入烧瓶底部，然后再将烧瓶直起，纸卷内的样品即完全放在烧瓶底部。 蒸馏完毕，先将蒸馏出口离开液面，继续蒸馏1min，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后移开酒精灯，绝不能先灭灯，否则吸收液将发生倒吸。 ?硼酸吸收液的温度不应超过40°C，否则氨吸收减弱，造成损失，可置于冷水浴中。 混合指示剂在碱性溶液中呈兰绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。 思考题： 写出一下各步的化学反应方程式: 蛋白质的消化 氨的蒸馏 氨的滴定 指出本测定方法产生误差的原因 消化过程中产生何种有毒气体？如何判断消化终点？ * * 消化过程 ： 含氮有机物+H2SO4 CO2+SO2+H2O+NH3 *