实验二蛋白质含量的测定凯氏定氮法.ppt

实验二 蛋白质含量的测定―凯氏定氮法 一 目的： 学习凯氏定氮法测定蛋白质含量的实验原理 掌握蒸馏、滴定操作技术 二、原理：蛋白质含N量约为16％，测出含氮量推知蛋白含量。 消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮- --硫酸铵。添加硫酸铜和硫酸钾的混合物，前者为催化剂，后者提高硫酸沸点。 CH2NH2COOH+3H2SO4 2CO2+3SO2十4H2O十NH3 2NH3+H2SO4 (NH4)2SO4 蒸馏吸收：浓碱使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到硼酸溶液中，硼酸吸氨后使溶液中的氢离子浓度降低，指示剂变色 (NH4)2SO4 + 2NaOH → Na2SO4 + 2H2O + 2NH3↑ NH3 + HBO2→ NH4BO2 （H3BO3 → HBO2 + H2O） 滴定：标准HCl滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止，根据所用标准酸的摩尔数(相当于待测物中氨的摩尔数)，计算出样品中的总氮量。 NH4BO2 + HCl → HBO2+NH4Cl 三、试剂与器材 1、消化液：H2O2：H2S04 ：H2O=3：2：1 2、粉末硫酸钾―硫酸铜混合物  K2S04与CuS04.5H20以 3：1混合 3、30％氢氧化钠溶液 4、2％硼酸溶液 5、标准盐酸溶液(约0.01 mol／L) 6、混合指示剂(田氏指示剂)  由50mL 0.1％甲烯蓝乙醇溶液与200mL 0.1％甲基红乙醇溶液混合配成，棕色瓶贮存。 酸性时为紫红色，碱性时为绿色。变色范围很窄且灵敏。 7、待测样品 四、操作方法 1. 消化前样品处理 固体样品: 某一固体样品中的含氮量是用100g该物质(干重)中所含氮的g数来表示(％)。 固体样品105℃烘干至恒重。 用坩埚钳将称量瓶放人干燥器内，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。每干燥1小时后，称重一次，直到两次称量数值不变，即达恒重。 若样品为液体(如血清等)，可取一定体积样品直接消化测定。 2、消化 取凯氏烧瓶 标号。各加几颗玻璃珠; 1及2号瓶中各加样品0.1g，催化剂200 mg，消化液5 mL。3及4号瓶中各加相同量的催化剂和消化液-----对照，以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。 消化开始时应控制火力，不使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力消化，直至消化液呈透明淡绿色。 定容：冷却后，加蒸馏水(慢加，随加随摇)。将瓶中液体倾入50 mL或100 mL容量瓶，并以蒸馏水洗烧瓶数次，洗液并入容量瓶，定容。 3、蒸馏吸收： 改进型凯氏定氮仪 特点：将蒸汽发生器、蒸馏器和冷凝器组成一个整体，体积小，安装容易，操作简便。 1)水蒸汽发生器和反应室 2)冷凝器和通气室 3)排水柱 关键：搞清水管系统 　蒸馏器的洗涤 １.接通冷凝水，向蒸汽发生器中加入一定量的水(以排水口高度为宜)，酒精灯加热烧开。 ２.水的自动喷出： 将蒸馏水从加样室加入反应室 将酒精灯移开片刻，反应室内水自动喷出到蒸汽发生器 打开蒸汽发生器出水口，放水。 如此反复清洗3-5次。 ３.清洗后在冷凝管下端放一锥形瓶盛有5 mL，2％硼酸溶液和1～2滴指示剂的混合液。如不变色则表明蒸馏装置内部已洗涤干净。 蒸馏吸收 准备: 取50 mL锥形瓶3个，各加入5 mL 硼酸溶液和1滴指示剂，溶液呈淡紫色，表面皿覆盖备用。 关闭冷凝水，打开自由夹，使蒸汽发生器与大气相通。将锥形瓶放在冷凝器下，冷凝器下端浸没在液体内。 加样: 移液管取3 mL消化液（空白液和样品消化液分别做），加入反应室，用小量筒加NaOH溶液5mL，关闭自由夹，少量水封口。 蒸馏: 关闭自由夹，打开冷凝水。 点燃酒精灯，蒸馏开始，锥形瓶中溶液由淡紫色变绿时(约2-3分钟)开始计时，蒸馏3分钟，移开锥形瓶，使冷凝器下端离开液面约1cm，继续蒸馏1分钟，取下锥形瓶，表面皿覆盖。 蒸馏完毕后，应立即清洗反应室，方法如前所述。 重复3次。最后将自由夹同时打开，将蒸汽发生器内的全部废水换掉，继续下一次蒸馏。 4、滴定 全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，硼酸指示剂溶液由绿变淡紫色为滴定终点。 注意：使用前检查酸式滴定管漏不漏？漏的话，涂凡士林 滴定时一边滴一边摇，防止滴定过头！ 及时记录读数 要求：空白液1次，样品消化液2次 5、计算 总