实验双缩脲法测定蛋白质含量.pptVIP

实验十 双缩脲法测定蛋白质浓度 一、实验目的 1. 学习常见蛋白质含量测定的原理和方法 2. 掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法 二、原理 一、分光光度法的基本原理及方法 （一）利用吸收光谱对物质进行定性分析 维生素B12溶液的吸收光谱 主要方法： （1）比较吸收光谱曲线 （2）比较最大吸收波长 蛋白质的最大吸收波长为280nm； 核酸的最大吸收波长为260nm。 （3）比较吸光度的比值 纯DNA： （二）利用吸收光谱对物质进行定量分析 1．原理 Beer-Lambert（比尔）定律： T=I/I0 A=lg1/T=lgI0/I A=εcl 其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射光强度；I为透射光强度； ε为摩尔消光系数；C为溶液浓度；L为溶液光程的厚度 2．常用方法 （1）标准曲线法 　　　　　　　　　　　　　　　　　 标准曲线与样品的测定条件必须一致。 （2）标准管法 CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX可求得CX。 （3）摩尔吸光系数法 C=A/?（?为L=1cm，C为1 mol/L时的吸光系数，也称为摩尔吸光系数。 微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量 被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测样品中氨的量（mol），根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。 因为蛋白质含氮量通常在16 %左右，所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数6.25，便得到该样品的蛋白质含量。 Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度 蛋白质含有两个以上的肽键(—CO—NH—)，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与Cu2+形成络合物。Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂(磷钼酸—磷钨酸试剂)，蛋白质—铜络合物能还原磷钼酸—磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏10—20倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。（Tris缓冲剂、蔗糖、硫酸铵、巯基化合物、酚、柠檬酸）。 紫外分光光度法测定蛋白质浓度 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280 nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值(OD280)与其含量呈正比关系，可用作定量测定。 利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品、可回收利用、低浓度盐类不干扰测定。 含有核酸的样品： 蛋白质浓度(mg/ml)=1.45×A280－0.74×A260 总蛋白定量分析－BCA（Bicinchoninic acid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉） ?准确灵敏：BCA试剂的蛋白质测定范围是20－2000μg/ml；Micro BCA试剂测定范围是0.5-20μg/ml ?快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便 ?经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样品和试剂用量 ?不受样品中离子型和非离子型去污剂影响 ?检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝 基本原理： 碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度 考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律 ，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍）。 Coomassie Dye-Based 蛋白质定量 PROTEIN + Amax = 595nm BLUE Acid Coomassie G-250 Protein - Dye Complex O CH 2 CH 3 NH C CH 3 CH 3 N CH 2 SO 3 - CH 3 CH 2 N CH 2 CH 2 CH 3 SO 3 Na + 双缩脲法测定蛋白质* 双缩脲反应：双缩脲在碱性条件下与铜离子结合生成紫红色化合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比。本法测定蛋白质范围1-10mg H2N-CO-NH2 + NH2-CO-NH2 H2N-CO-NH-CO-NH2 ＋NH