第十一章蛋白质的生物合成介绍.ppt

一、基因工程及相关概念 1.DNA重组 不同来源的DNA分子可以通过磷酸二酯键连接形成重新组合的DNA分子，称为DNA重组。 2.基因工程 实现基因克隆所采用的方法及相关的工作称基因工程, 又称重组DNA工艺学。 是在基因水平上操作并改变生物遗传性的技术。 3.限制性核酸内切酶 限制性内切核酸酶就是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。 二、基因工程的主要步骤 （一）目的基因的获取 概念：目的基因是指为某一特定目的所需要的 DNA片段，又称为目的DNA。 方法：1、基因组DNA文库 2、制备cDNA文库 3、PCR 4、化学合成 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的 氨基酸序列 。 （二）基因载体的选择与构建 ★基因载体 是指运载目的基因进入宿主细胞进行 扩增和表达的DNA分子。 ★常用基因载体： 1.质粒 存在于细胞染色体外的环状小分子双链 DNA。 2.噬菌体 是感染细菌的一类病毒 3.粘粒 是将噬菌体与质粒组合的装配型载体。 4.病毒 结构简单，易改造和操作，转染率较 高，理想的载体。 ★基因工程的目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。 （三）目的基因与载体的连接 将目的基因插入载体，用DNA连接酶连接双链DNA粘性末端序列，在体外重新连接成人工重组体。方法主要有以下四种： 1．粘性末端连接 2．同聚物加尾连接 3．平末端连接 4．人工接头连接 （四）重组 DNA 导入宿主细胞 常用的方法有以下两种： 1.转化(transformation) 将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。 2.感染(infection) 以噬菌体进入宿主菌或病毒进入宿主细胞中繁殖的过程。 （五） 重组体的筛选 1、遗传学方法 针对载体携带有某种或某些标志基因和目的基因而设计的筛选方法。 2、分子杂交法 利用32P标记的探针与转移至膜上的重组DNA或克隆的DNA片段进行分子杂交，直接筛选并鉴定目的基因。 3、免疫学方法 利用特异性抗体与目的基因表达产物特异结合的方法筛选。 （六） 克隆基因的表达 利用重组DNA技术所获得目的基因或DNA序列，可实现在受体细胞中的表达，即产生mRNA或蛋白质产物。 ★ 重组DNA技术操作过程总结归纳 分 切 接 转 筛 分离目的基因 限制酶切目的基因与载体 拼接重组体 转入受体菌 筛选重组体 ★ 重组DNA技术操作的主要步骤 载体 质粒 噬菌体 病毒 目的基因（外源基因） 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物 限制酶消化 开环载体DNA 目的基因 连接酶 重组体 转化 体外包装，转染 带重组体的宿主 筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交 三、基因工程与医学的关系 （一）基因工程用于医学基础研究 建立人类染色体的基因文库，为进一步寻找基因、分析基因序列奠定基础。 （二）基因工程用于疾病诊断和治疗 1. 基因诊断： 应用基因工程的原理和方法，在基因水平上对疾病进行诊断称之为基因诊断。 2. 基因治疗： 通过基因工程的方法， 向有功能缺陷的细胞导入具有相应功能的外源基因， 纠正或补偿基因缺陷而达到治疗的目的， 称为基因治疗。 （三）基因工程用于生产蛋白质类药物 ①利用基因工程技术改造传统的制药工业 ②利用克隆表达的基因生产药用肽类和蛋白质。 （四）基因工程用于转基因动植物 转基因动物在医学上可用作特定的实验模型，还可以用于生产药用蛋白质。甚至可用于器官移植。 （五）基因工程用于人类基因组计划 人类基因组计划的目标是分析人类基因组DNA的全部核苷酸序列， 编码序列，确定基因的位置及其功能，与人类遗传病相关的致病基因的定位、克隆、功能研究和测序等发现新基因、探明疾病发病机制、预见发病风险和诊断疾病。 （六）遗传病的预防 1．产前诊断 可以通过胎儿组织活检、羊膜腔穿刺、 羊膜绒毛样品及母体血循环中的胎儿细胞进行遗传病的产前基因诊断。 2．携带者测试基因