第十章电泳技术介绍.ppt

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理是阴离子去污剂SDS（十二烷基磺酸钠）能以一定比例和蛋白质结合并使蛋白质分子带有大量的负电荷，大大超过其原来所带电荷，从而使各天然蛋白质分子间的电荷差别下降乃至消除。 同时蛋白质的结构也在SDS作用下变得松散，形状趋于一致，排除了电泳过程中电荷的影响，使SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳时，蛋白质迁移率的差异仅是相对分子质量的函数。 （10-9） 式中M为相对分子质量；A为常数；K为斜率；Rm为迁移率。 由于蛋白质结合SDS的量与蛋白质的种类有关，并受溶液pH值、离子强度和缓冲液组分的影响，这些因素使相对分子质量的测定产生偏差，所以一般都必须用已知相对分子质量的蛋白质作为“指示蛋白”与被测样品在同一条件下进行电泳，然后标绘出lgM-Rm曲线，求出样品的Rm值对应的lgM值，计算出被测样品的相对分子质量。 四．等电聚焦 等电聚焦简称电聚焦，是20世纪60年代后期发展起来的新技术，也是一种依据净电荷的不同来离析分子的方法。 它能用于大规模分离两性物质，如蛋白质等。 等电聚焦的基本原理是利用电场和pH梯度的复合作用来实现两性物质的选择分离。如果把一种两性电解质置于一个连续跨接的外加pH梯度下，并且施加一个电场，那么这种物质将按照它的电荷迁移。 如果这种物质在初始位置的pH值下呈负电荷，它将向阳极迁移，随着迁移，它将遇到pH值的逐渐降低，所以它的荷电状况会发生变化。 迁移到pI处时，它将呈电中性状态，这样，在均一的电场中，这种物质将停止移动，因为作用于它的有效电动力将趋于0。在混合物中的每种物质也将这样移动，直至它达到自己的等电点。 等电聚焦的主要优点是混合物可以达到完全分离，而且只要电场保持不变，扩散和对流迁移就不会影响分离的有效性。 五．双向电泳 到目前为止具有最高分辨率的电泳技术是双向电泳，这一技术由等电聚焦和SDS凝胶电泳依次组合而成。 例如将蛋白质混合样品，先在4％聚丙酰胺凝胶棒中等电聚焦，按等电分离，然后用不连续缓冲系统的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，按分子大小进行分离。 人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。 * 一．自由界面电泳 1937年瑞典科学家Tiselius建立了“移界电泳法(moving boundary EP)”，成功地将血清蛋白质分成清蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白5个主要成分，由于他的突出贡献，1948年荣获诺贝尔奖金。 在自由界面电泳中，样品被放置在U型电泳管的缓冲溶液中，然后外加电场。 在几种组分的混合物中，由于不同离子的电量、大小和形状的不同导致它们在缓冲液中的移动速度不同，结果在整个管子中出现了不同的分隔界面。 在一系列的分界范围中，是以组分的浓度变化参差而排列的，这样的浓度梯度可用一个适宜的光学系统进行测量。 通过整个管子的连续量析技术，就可以确定不同界面的位置、数量以及区域的浓度，因此可用来测量电泳迁移率，进行混合组分的分离和分析等。 自由界面电泳由于仪器装置复杂、价格昂贵，因此只限于实验室规模操作。 二．自由溶液中的区域电泳 1．微量电泳 微量电泳是一种基于单个粒子受到电场作用时会移动非常小的距离的事实来测量带电粒子迁移率的高度专业化方法。 电泳迁移率可通过测量一个粒子走过一定距离所需的时间来计算求得。所走的距离可从显微镜目镜的分度尺上读出，可调节元件两端间的电位，使测量时间控制在10秒左右。 2．自由流动电泳 这是一种较大规模的分离带电粒子的方法，与其它电泳方法相比，可溶物质的分辨(例如蛋白质)非常差，它在细胞分离操作上的主要优点是能很好地保持细胞的存活力。 电泳仪有一个分离槽，分离的样品被缓冲溶液围着，在槽的顶端一小口中注入样品，随着样品的移动，不同的成分分离成单个区带按不同的偏斜方向经过分离槽，如果样品不断地从槽的上端泵入，组分沿一系列对角线方向移动，可在另一端不同部位上收集到被分离的组分。 3．密度梯度区域电泳 如果区域电泳是在简单缓冲液中进行的，由于被分离区域的扩散和沉降，会发生分辨率的严重下降，但利用密度梯度电泳时，这两种因素产生的影响会大大降低。 密度梯度区域电泳几乎总是在垂直柱中进行，典型的蔗糖密度梯度从10％～50％左右，密度梯度越陡斜，阻止对流和样品区带重力沉降的稳定能力越大，所以，样品承载能力也越大。 4．葡聚糖凝胶柱上的区域电泳 多数