第四章沉淀法介绍.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 思考题： 什么是沉淀法，具体包括哪些方法？ 理解概念：硫酸铵饱和度，盐溶， 盐析 盐析的机理是什么？ 影响盐析的因素有哪些？ 有机溶剂沉淀蛋白质的机理什么？ 沉淀蛋白质时应注意哪些事项？ 何为选择性变性沉淀法？ 人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 4.9 选择性变性沉淀法 选择性变性沉淀法：选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀下来，而与目的物分开。 原理：利用蛋白质、酶和核酸等生物大分子对某些物理或化学因素敏感性不同，有选择地使之变性沉淀，以达到分离提纯的目的。 方法可分为：1）利用表面活性剂或有机溶剂引起变性；2）利用对热的不稳定性，加热破坏某些组分，而保存另一些组分；3）酸碱变性。 选择性变性沉淀法是使杂质变性沉淀，又对目的物没有明显影响，所以在操作之前要对欲分离的物质中的杂蛋白等杂质的种类、含量及其物理化学性质等有比较全面的了解。 例如对于α-淀粉酶等热稳定性好的酶，可以通过加热进行热处理，使大多数杂蛋白受热变性沉淀而被除去。 选择性变性沉淀法 选择性分离核酸 酚、氯仿、十二烷基磺酸钠等，目的是使核酸和蛋白质分离，蛋白质变性沉淀，核酸则存在于水溶液中。 在核酸提取液中加入氯仿-戊醇或氯仿-辛醇，振荡一段时间、使蛋白质在氯仿-水的界面上形成沉淀而被除去，核酸仍然留在水溶液中。 在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，用苯酚-水溶液提取核酸，DNA、RNA在水溶液中，而蛋白质在苯酚层中形成沉淀而被除去； 在DNA、RNA混合溶液中，用异丙醇选择性地沉淀DNA，而RNA留在溶液中。 硫酸链霉素和鱼精蛋白沉淀核酸：硫酸链霉素和鱼精蛋白为多价阳离子，带有大量正电荷，可使带大量负电荷的核酸发生直接沉淀。 由于成本偏高，加之沉淀后分离较困难，使用不多。 从氨基酸混合液中(如蛋白质水解液)提取某种特指氨基酸时，除采用等电点沉淀，柱层析等方法外还可使用一些特殊的沉淀剂。 如从猪血纤维水解液中制取组氨酸时，用氯化汞使其形成汞盐析出。沉淀洗净后制成悬液，再向沉淀中通入H2S气体即可使组氨酸重新游离。 从酵母酸性提取液中分离谷胱甘肽时，先使其生成亚铜盐沉淀，然后以H2S解析，再用丙酮将谷胱甘肽沉淀析出。 氨基酸类沉淀剂 苯甲醛沉淀精氨酸 邻二甲基苯磺酸沉淀亮氨酸 苯偶氮苯磺酸沉淀丙氨酸和丝氨酸 2,4-二硝基萘酚-7-磺酸沉淀精氨酸 二氨合硫氰化铬氨沉淀脯氨酸和羟脯氨酸 分离粘多糖的沉淀剂 乙醇 十六烷基三甲基季胺溴化物(简称为CTAB)， 十六烷基氯化吡啶 （阳离子表面活性剂） 季胺基上的阳离子与粘多糖分子上的阴离子可以形成季胺络合物。此络合物在低离子强度的水溶液中不溶解，但当溶液离子强度增加至一定范围，络合物则逐渐解离，最后溶解。 除了离子强度的影响外，CTAB对各种粘多糖的分级沉淀效果与各种粘多糖硫酸化程度和溶液pH值有关。 CTAB的沉淀效力极强，能从很稀的溶液中(如万分之一浓度)通过选择性沉淀回收粘多糖。 各种沉淀方法应用范围 盐析法：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 有机溶剂沉淀法：多用于生物小分子、多糖及核酸的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。 等电点沉淀法：用于氨基酸、蛋白质等两性物质的沉淀。多与其它方法结合使用。 非离子多聚体沉淀法：用于分离生物大分子。 生成盐复合物沉淀：用于多种物质(特别是小分子) 选择性沉淀（热/酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。 沉淀法应用 沉淀法应用 酵母醇脱氢酶的分段盐析 尿激酶的沉淀分离 沉淀法大规模提纯血浆蛋白 胰蛋白酶的提取 柠檬酸的提取 四环素的提取 生活例子：咸鸭蛋 1、分段盐析法分离酵母醇脱氢酶 过滤液经过30%丙酮沉淀杂蛋白后，然后进行分段盐析 分段盐析法分离酵母醇脱氢酶 丙酮沉淀杂蛋白后粗酶的比活上升4.94倍． 分段盐析中饱和度在50％～55％区段中析出的组分与粗酶相比其比活上升9.62倍， 工艺优点： 丙酮沉淀杂蛋白后，再加大丙酮浓度使粗酶沉淀的过程,如果不在低温下逐滴加入冷丙酮，酶活力极易丢失。 而盐析中，硫酸铵的加入会稳定蛋白质的构象，使之难于变性,所以在分段盐析中酶的总活力很少丢失。 分段盐析可以