二、基本知识及基本技术.ppt

利用6bp长度的随机序列引物扩增细胞中的总DNA，将会得到许多非特异性产物，反映了该引物序列在基因组中的分布状况。 （3）基因组的比较研究 比较不同物种之间的基因组特征和相似性。 类似于限制性内切酶片断长度多态性（RFLP）分析，因而也称为随机扩增多态性DNA（RAPD）分析。 RAPD (Random amplified polymorphism DNA) 第三节 核酸的分子杂交 当带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起时,其特定的同源区段会退火形成双链结构,如果彼此退火的核酸来自不同的生物,则所形成的双链分子就叫杂种核酸分子. 广泛地应用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。 A 基本理论 DNA变性 DNA复性 核酸分子杂交 B 印记 在杂交反应中,经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子都是在杂交之前通过毛细管作用或电导作用被 转移到滤膜上,且按其在凝胶中的位置原位地”复印”上去. C 杂交的一般程序 DNA-DNA或DNA-RNA链杂交。用放射性同位素 （32P或125I）标记的DNA或RNA探针。 核酸探针 在退火时能与被测样品中的目的DNA相应序列互补的已知核酸片断.人工合成的寡核苷酸,基因组DNA,特异的PCR产物,cDNA,单链DNA及RNA. 探针标记物要求: 不影响探针的主要理化性质;灵敏度高,特异性强,重复好;操作简便;稳定性高,易于保存;安全,无污染. 标记物的类型: 1)放射性标记物:用放射性同位素对核苷酸进行标记后的产物.32P.3H.35S.14C 2)非放射性标记物:无放射性污染,分辨力高,稳定性好,但敏感性及特异性较差.生物素标记的核苷酸. 标记探针的方法: 1)体内标记 2)体外标记:化学法和酶促法 一、Southern blot 用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。 D 常用分子杂交类型 Southern blot 筛选结果 二、Northern blot 用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。用于研究基因表达 变性凝胶电泳:单链RNA易形成高级结构,使用变性剂有甲醛,乙二醛,尿素等. 电泳过程中始终要有抑制RNase作用 杂交前,干燥后的固相膜会由于变性剂的存在而干扰杂交灵敏度,先将膜泡在Tris-His缓冲液中95度5-10分钟,可洗脱与RNA结合的甲醛. 三、原位杂交 对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。 需要目的基因的探针 四. 组织原位杂交 五. 斑点杂交 六 .免疫印记 1970年人们就有足够的理论知识来提出目前所用的快速DNA序列分析法。但当时在认识上和技术上存在两个问题： 当时没有能把不同长度的核苷酸片断分离开的技术。 当时的分析思路局限于RNA序列分析法。 第五节 DNA序列分析 （1965年Cornell大学的S.W. Holley等首次测定了75bp的酵母丙氨酸tRNA全序列。使用的是降解片断法）。 Sanger等1977年发明。 一、双脱氧链终止法 Frederick Sanger, 1980年Nobel Prize化学奖 （1）DNA复制是以一条链为模板，按碱基配 对的原则进行的。 （2）脱氧核糖的连接是以3’?5’磷酸二脂键。 （3）复制反应可以在体外进行。 （4）2’和3’双脱氧的ddNTP会使复制反应终止。 1. 原理 DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链。 （3）DNA链的延伸 TGCATGCAT ATCTTGAAC 3’ 5’ 5’ TAGAACTTG ACGTACGTA 3’ 模板 模板 ATCTTGAAC 5’ ACGTACGTA 5’ Taq Taq 72oC 理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA。 变性—复性—延伸。 （4）1个循环的结果 （5）新一轮循环开始 3. PCR的过程 （1）第一步 变性（denature） 94-95 oC下5分钟，模板DNA双链完全变性成单链。 在0.5mlEP管中依次加入以下成分: 10×PCR缓冲液 5μl； MgCl２ 3μl； dNTP 4μl； 引物1, 2μl； TaqDNA聚合酶 0.5μl 引物2 , 2μl； HaSNPV基因组DNA 1μl； d