亲和素和生物素系统.ppt

亲和素和生物素系统 亲和细胞化学不同于免疫细胞化学，亲和细胞化学是利用两种物质之间的高度亲和能力而相互结合的化学反应。 目前，亲和组织化学中的亲和物质包括亲和素与生物素、植物凝集素与糖类、葡萄球菌A 蛋白（SPA ）与IgG、抗原与抗体、阳离子与阴离子、激素与维生素和脂质与受体等。 亲和素和生物素系统 亲和素和生物素系统是在免疫组织化学技术方法上不断加以改进，与细胞生物化学紧密结合后的产物。 这种方法使免疫组化技术的敏感性得到进一步提高，更有利于微量抗原（或抗体）在细胞或亚细胞水平的定位，扩大了其应用范围。 生物素 生物素（biotin ），也称维生素H，是一种分子质量为244Da 的小分子维生素。 抗体分子经生物素化后，其结合抗原的能力不受损失，细胞经生物素化后仍能保持正常的分裂、增殖能力，因此被用作抗体、细胞的标记。 亲和素 亲和素（avidin）是一种分子质量为68000Da的一种碱性糖蛋白。亲和素具有与其他示综物质，如，荧光素、酶、胶体金等，结合的能力。 生物素和亲和素之间有极强的亲和力，比抗体对抗原的亲和力要高出100 万倍。 亲和素有4 个亚单位，它具有4 个同生物素亲和力极高的结合位点，因其能使生物素失活，故又称抗生物素。 链霉亲和素 链霉亲和素（streptavidin ）是一种从链霉菌培养物中提取的蛋白质，相对分子质量60000，且不含糖链。 同亲和素一样，链霉亲和素也具有4个生物素结合位点，亲和力高达10－15 mol/L，是一种更完美的生物素结合蛋白。因为它很少有低聚糖残余成分，可保持中性等电点，避免了组织中的非特异性染色。 标记亲和素-生物素法（labeled avidin biotin，LAB） 将亲和素与标记酶（HRP）结合，一个亲和素可结合多个HRP 将生物素与抗体（一抗或二抗）结合，一个抗体分子可连接多个生物素分子 细胞的抗原（或通过一抗）先与生物素化的抗体结合，继而将酶标记亲和素结合在抗体的生物素上，如此多层放大提高了检测抗原的敏感性。 桥接亲和素-生物素法（bridged avidin biotin，BAB）　　 先使抗原与生物素化的抗体结合，再以游离亲和素为“桥”将生物素化抗体与酶标记生物素连接，也可达到多层放大效果。 亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法（avidin biotin-peroxidase complex，ABC） 此方法为前两种方法的改进，即先按一定比例将亲和素与酶标生物素（或称生物素化酶）结合，形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC 复合物）。 ABC 复合物不能饱和，即亲和素上的4 个结合位点最多允许3 个位点与生物素化酶结合，留1~2 个位点与生物素化二抗结合。 抗原先后与特异性一抗、生物素化二抗、ABC 复合物结合，最终形成巨大复合体，因该复合体网络了大量酶分子，从而提高了检测的灵敏度。 标记链霉亲和素-生物素法（Labelled streptavidin biotin ，LSAB） 它是采用生物素标记的第二抗体与结合有HRP 或AKP 酶的链霉亲和素（streptavidin ）连接来测定细胞及组织中的抗原。 链霉亲和素同一定浓度的生物素化酶混合后，就能形成链霉亲和素-生物素-酶复合物，这种复合物中至少存在1 个尚未被生物素占据的链霉亲和素结合位点，可以和各种生物素标记抗体结合。由于采用了改良的亲和纯化技术和酶标技术，LSAB 法敏感性更高、背景更清晰。 LSAB法优缺点 此方法与ABC 法相比，不需A、B 两液提前混合，操作者容易掌握，稳定性高，由于采用了低等电点的链霉亲和素，其内源性生物素干扰要低于ABC 法。 该法生物素化二抗和链霉亲和素HRP （AKP）的孵育（室温）时间仅需10?15min，其敏感性和所用时间与EnVision 法一致。 最大的缺点是内源性生物素的干扰。 * *