柱前衍生高效液相色谱法测定肝纤维化兔给药后尿羟脯氨酸含量.pdfVIP

第36卷 分析化学(FENXIHUAXUE)研究简报 第6期 of 811—814 ChineseJournal 2008年6月 AnalyticalChemistry 柱前衍生高效液相色谱法测定 肝纤维化兔给药后尿羟脯氨酸含量 ‘ 夏莉 梁逸曾’ 王平 (中南大学化学化工学院中药现代化研究中心，长沙410083) 摘要建立了一种快速测定羟脯氨酸的反相高效液相色谱法(RP-I-IPLC)，并测定了血吸虫病肝纤维化兔 给药中药复方口服液(HDS)前后尿液中羟脯氨酸含量变化。采用9-芴基甲氧基羰酰氯(FMOC)为衍生试剂， 以3，4-脱羟脯氨酸为内标，在Zorbax SB-C，。柱上用甲醇和醋酸钠缓冲溶液为流动相进行梯度洗脱，二极管阵 nnl处检测。羟脯氨酸在5．0—200 列检测器(DAD)262 tunol／L浓度范围内呈良好线性相关系(r=0．9999)， 方法检出限为2．0ttmol／L(S／N=3)，回收率为96．5％一99．0％。本方法具有样品处理步骤简单、准确度高、 重现性好、分离时间短等优点，适合大批量样品测定。 关键词 羟脯氨酸，9-芴基甲氧基羰酰氯，柱前衍生，高效液相色谱法，肝纤维化 1．引 言 羟脯氨酸在胶原蛋白的含量约为14％，是胶原蛋白特有成分，测定组织或血、尿中的羟脯氨酸含量 已作为人体胶原蛋白代谢的生化指标，被认为是评估胶原蛋白含量和肝纤维化程度的指标¨J，并开始 作为抗肝纤维化药物疗效的考核指标，为抗肝纤维化药物的研制与疗效评价提供一种重要手段。 羟脯氨酸的测定方法有化学比色法、电泳法、氨基酸分析仪测定法、高效液相色谱法、液质联用法和 气质联用法等。高效液相色谱(HPLC)以其检测用样量少，灵敏和快速等特点，在测定生物组织和体液 中的羟脯氨酸含量中被大量采用旧“J。高效液相色谱法分析羟脯氨酸时常用的柱前衍生试剂有邻苯二 甲醛(OPA)D 有机溶媒萃取和固相提取的方法先除去OPA与一级胺衍生物，再用FMOC衍生羟脯氨酸进行分离。此 法虽选择性好但样品处理费时，不适合处理大批量样品。鉴于此，本实验采用FMOC直接衍生样品，通 过优化液相色谱分离条件，采用梯度洗脱20min即可分离出羟脯氨酸产物峰，并测定了血吸虫病肝纤 维化家兔喂服中药复方口服液(HDS)后尿羟脯氨酸的含量。 2 实验部分 2．1仪器与试剂 HPl mol／L 羟脯氨酸(Hyp)标准溶液：用0．1HCI准确配制浓度为1 moL／L 标准储备液；内标(IS)3，4一脱羟脯氨酸标准液：用0．1HCI精确配制浓度为100 3，4．脱羟 ttmol／L mol／L 脯氨酸(美国Sigma公司)溶液；O．05 现用现配；0．2mol／L硼酸缓冲液(pH9．0)。甲醇为色谱纯(江苏汉邦)；所用试剂均为分析纯以上，水 2007-07—16收稿；2007一ll-15接受 本文系国家自然科学基金(No和科技部国际科技合作项目(No．2007DFA41090)资助 ·E-mail：yizen-uang@263．eOnl 812 分析化学 第36卷 溶液试剂均用二次蒸馏水配制。 中药复方口服液(HDS)由中南大学中药现代化研究中心研究制备，置于冰箱中4℃保存。 2．2样品收集与处理 2．2．1动物实验选择体重2．O一2．5kS／只的家兔32只，由湖南省血吸虫病防治研究所提供。每只兔 子经腹部皮肤感染日本血吸虫