第7章蛋白质的分离、纯化和表征案例.ppt

孔径不连续性 缓冲体系离子成分及pH值的不连续性（前导离子CI-,尾随离子Gly） 电位梯度的不连续性 7.5.4.1 羟基磷灰石层析 结晶磷酸钙 分离蛋白质、核酸 蛋白质的分离纯化方法 7.5.4.2 疏水作用层析 蛋白质存在于分子表面的疏水氨基酸残基的数量是不同的。 连接在支持介质（如琼脂糖）上的疏水基团与蛋白质表面上暴露的疏水基团结合。 使用逐渐降低离子强度或增加pH的洗脱液。 蛋白质的分离纯化方法 7.5.5 利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法 亲和层析 (Affinity Chromatography) 蛋白质的分离纯化方法 (2) Specific Binding Substance (B) 溶 離 Elution (4) 配 體 Ligand (A) 耦合反應 (3) Coupling Reaction 雜 質 B B B B (1) Solid Matrix B 亲和层析的原理 蛋白质的分离纯化方法 Affinity Chromatography Affinity chromatography exploits the specific, high affinity, noncovalent binding of a protein to another molecule, the ligand. First, the ligand is covalently attached to an inert（惰性的） and porous matrix（基质）. The protein mixture is then passed down a column containing the immobilized（固定化的） ligand. The protein of interest will bind to the ligand, whereas all other proteins pass straight through the column. Affinity Chromatography After extensive washing of the column with buffer to remove nonspecifically bound proteins, the bound protein is release from the immobilized ligand either by adding soluble ligand which competes with the immobilized ligand for the protein, or by altering the properties of the buffer (changing the pH or salt concentration) Affinity Chromatography 固相擔體 (1) (2) (3) A B Sample Washing Elution X B 親和基團 配體 X B A A 亲和层析的原理 蛋白质的分离纯化方法 Activity Protein 改变洗脱条件 * Elution volume 亲和层析的原理 蛋白质的分离纯化方法 加样淋洗 亲和层析的 应用 抗原和抗体 激素和受体蛋白 凝集素和糖蛋白 金属螯合亲和层析 蛋白质的分离纯化方法 7.5.6 高效液相层析和 快速蛋白液相层析 是离子交换、分子排阻、吸附和分配等层析技术的发展。 对柱层析来说，载体的颗粒愈小、则分辨率愈高，但是洗脱液的流速也愈慢。为解决这一矛盾，采用高压和颗粒度小而均匀、机械性能强、化学性能稳定的固定项以及其他相应的设备。 蛋白质的分离纯化方法 蛋白质的含量测定与纯度鉴定 实用中经常是多种方法联合使用 7.6 蛋白质的含量测定与纯度鉴定 Protein content and purity determination 7.6.1 蛋白质含量测定 凯氏定氮法 双缩脲法 Folin—酚试剂法（Lowry法） 紫外吸收法 染料结合法(Bradford法) 胶体金测定法 7.6.2 蛋白质纯度测定 电泳 等电聚焦, PAGE, SDS, 毛细管电泳 纯的蛋白呈一条带或峰 沉降 纯的蛋白以单一沉降速度运动 HPLC 纯的蛋白为单一的对称峰 溶解度分析 纯的蛋白质溶解曲线只呈现一个折点 蛋白质的含量测定与纯度鉴定 7.蛋白质的分离、纯化和表征作业 名词解释 等离子点，沉降系数，盐析，盐溶， 密度梯度离心，透析，超过滤 Gel Filtration Chro