测定化学物对萤光素酶抑制毒性的微板发光法研究.pdfVIP

第33卷，第10期 光谱学与光谱分析 201 and October，2013 3年10月 SpectroscopySpectralAnalysis 测定化学物对萤光素酶抑制毒性的微板发光法研究 葛会林1’2，刘树深孙，陈 浮2，罗金辉1，吕岱竹1，苏冰霞1 1．中国热带农业科学院分析测试中心，海南省热带果蔬产品质量安全重点实验室，海南海口 571101 2．同济大学环境科学与工程学院，长江水环境教育部重点实验室，上海200092 摘要基于萤火虫萤光素酶生物发光反应体系，以SpectraMaxM5酶标仪为发光强度测试设备，建立了 测定化学物对萤光素酶抑制毒性的微板发光测试薪方法。系统地研究了萤光素酶浓度、萤光素浓度、ATP 浓度、pH、温度、反应时间等实验条件对发光强度的影响。发现ATP对发光呈现双相响应关系，最大发光 度出现在ATP浓度为1．1×10¨4 酶的发光抑制毒性效应，基于非线性最小二乘法拟合化学物对萤光素酶毒性的剂量一效应曲线(DRc)，拟合 效应与实验结果之间的决定系数(R2)均大于0．99。通过拟合的DRC参数，准确地计算了化学物的半数效应 浓度EG。。对比有关文献方法，萤光素酶毒性测试的微板发光法具有更简便快捷，节省试剂药品，便于多次 平行测定从而提高准确度等优点。 关键词萤光素酶；微板发光法；最小二乘法；剂量一效应曲线；ATP双相响应 DOh J 10—2766—05 中图分类号：0657．3文献标识码：A 10．3964／j．issn．1000—0593(2013 杂。而基于发光菌发光抑制原理的Microtox方法[6]解决了 引 言 上述问题，并且数据的准确性和重复性也明显提高。基于化 学或生物发光原理的商用生物毒性测定仪还有美国哈希 随着近代工业的发展，化学物质的使用日益增多，使人 类赖以生存的水生生态系统受到了越来越严重的污染。虽然 基于辣根过氧化酶催化的化学发光反应受到抑制的原理。萤 监测环境污染物的各种分析方法的灵敏度越来越高[1]，但是 火虫发光属于生物发光的一种，其内在的生物化学反应是萤 大多数研究者都是关注单一污染物对生物体和生态系统的毒 光素酶催化氧化底物n萤光素，能量从三磷酸腺苷(ATP) 性效应，而环境中的生物体常常是暴露于多种污染物共存的 转移到D萤光素并伴随发光的过程[7]，可以用反应方程式表 混合体系中。对于综合性样品的处理研究表明，未知样品毒 性的特异性化学分析检测只占其毒性检测的很少一部分。化 c02十PE+hv。萤光素酶对环境中存在的微量有毒有害物质 学分析虽然灵敏、准确，但由于时间、费用以及对样品的不 非常敏感，当环境中存在毒物时，会改变其活性，且反应产 可知性等因素使其在毒性的实际筛选中受到很大限制。另 生的光强度随毒物含量而改变。已有研究报道某些金属离子 外，混合样品中不同的化合物彼此之间存在着加和[2]、协 和非金属离子以及农药会在不同程度上抑制萤光素酶活 同嘲或拮抗“]作用，即使单个污染物都处于最大残留限量 性[8]，以及将萤光素酶用于表征单个化合物[9]和混合物的毒 性C10]。因此需要建立一种快速检测水中化学物综合毒性的 (MRL)以下或无明显观察效应浓度(NOEC)，混合物仍然可 能导致显著的毒性效应[5]。最终的毒性作用并非单一物质毒 分析方法，为今后利用萤光素酶发光体系评价水中污染物的 性的简单加减，因此必须使用生物方法对综合的毒性效应 综合毒性奠定基础。 (尤其对于未知物)进行测定。 萤光素酶催化发光反应的一个重要应用，是通过发光