溴化氰裂解结合电喷雾串联质谱测定电泳分离蛋白的C端序列.pdfVIP

第36卷 分析化学(FENXIHUAXUE)研究简报 第4期 of 514—517 ChineseJournal 2008年4月 AnalyticalChemistry 溴化氰裂解结合电喷雾串联质谱测定 电泳分离蛋白的C端序列 高彦飞 李萍 王鸿丽 刘炳玉 魏开华 张学敏 杨松成 王红霞’ (国家生物医学分析中心，北京100850) 摘要C端测序是蛋白质及多肽一级结构确认的重要组成部分，也是重组蛋白药物质量控制的重要依据。 建立了溴化氰裂解结合电喷雾串联质谱测定蛋白质C端序列的方法，并应用于重组人肿瘤坏死因子受体和 纽兰格林的c端测序。首先根据待测蛋白序列进行溴化氰理论裂解，如果C一端肽段理论分子量在500一 5000 U之间，则将待测样品进行SDS．PAGE分离，考马斯亮兰染色，然后进行胶内溴化氰裂解，最后应用基质 辅助激光解I绣y电离飞行时间质谱(MALDI-TOF—MS)测定c一端肽段的分子量，电喷雾串联质谱对c端肽段进 行测序。应用本方法分别测定了这两个蛋白质C端19个和11个氨基酸残基序列。研究结果表明：本方法灵 敏、有效、实用性较强，可适用于部分重组蛋白药物的质量控制和蛋白质的结构确证，是对目前蛋白质C端测 序方法的有效补充。 关键词c端测序，溴化氰裂解，电喷雾串联质谱，重组蛋白 1 引 言 随着基因工程和蛋白质工程的发展，越来越多的重组蛋白药物将被研发并走向市场。为保证重组 蛋白药物的质量，中国药品和食品监督管理局规定：重组蛋白药物报批必需提供包括N端、C端、二硫 键、肽质量指纹谱等有关一级结构确证的数据。因此建立蛋白质c端测序方法并应用于重组蛋白药物 C端测序具有很高的实用价值和学术意义。 C端序列是蛋白质的重要结构与功能部位，对蛋白质的生物功能起非常重要的作用¨，2J。目前，蛋 白质C端序列测定的主要方法有化学法、酶切结合串联质谱法等。化学法的主要缺点是由于偶联试剂 和裂解试剂的限制，最终产率与重复产率偏低，同时，该方法有灵敏度不高(20—100pm01)，遇到特殊的 氨基酸，如脯氨酸不易测定等缺点”]。酶切结合串联质谱法有一定的序列依赖性，有时由于找不到合 适的酶或酶切肽段离子化程度差而在串联分析时找不到待测峰。本研究建立了溴化氰裂解结合ESI— MS／MS测定蛋白质C端序列的方法并成功应用于重组人肿瘤坏死因子受体(rhTNFR)和重组人纽兰格 林(neuregulin)的C端序列分析，为重组蛋白药物的c端测序分析提供了一种新的有效分析方法。 2 实验部分 2．1仪器与试剂 Scientific公 49kDa)和重组人纽兰格林(Mr=8kDa)由军事医学科学院生物工程研究所提供。 2．2样品制备 2．2．1 X上样缓 SDS分离蛋白称取蛋白样品约40斗g，用双蒸水溶解至1g／L，加人等体积2 2007-08-30收稿；2007．10-28接受 本文系北京市自然科学基金资助项目(No．2062022) ·E—mail：wb．x@proteomics．cn ‘ 第4期 高彦飞等：溴化氰裂解结合电喷雾串联质谱测定电泳分离蛋白的c端序列 515 冲液，沸水煮3rain。12000r／min离心2 凝胶为不连续胶(分离胶浓度为12％，浓缩胶为5％)。电泳时使用恒流法(浓缩胶为10mA，分离胶为 20 ma)。电泳结束后用10％乙酸-40％乙醇固定30min，考马斯亮兰R250染色30min，10％乙酸脱色 过夜。 2．2．2胶内溴化氰裂解将蛋白带切下，用含50％乙腈的25mmol／L碳酸氢铵脱色，纯乙腈脱水。 10mmol／L二硫苏糖醇56℃还原30