八种常用生化实验步骤.doc

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八种常用生化实验步骤

实验一 基因的PCR扩增技术 一、实验目的与原理简介 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)是体外克隆基因的重要方法,它可在几个小时内使模板分子扩增百万倍以上。因此能用于从微量样品中获得目的基因,同时完成了基因在体外的克隆,是分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。 常规PCR反用于已知DNA序列的扩增,具体可分为三个主要过程:一、变性。通过升高温度使DNA双链模板分子中氢断裂,形成单链DNA分子,温度为94℃,时间1min。二、复性。降低温度使DNA单链分子同引物结合。温度为55℃,时间1min。三、延深。升高温度,在DNA聚合酶最佳活性的条件下在引物3端加入dNTP,实现模板的扩增,温度为72℃,时间2min。同时第一步变性前要在94℃下预变性5分钟,使DNA双链完全解开。经过 25-35个循环之后,在72℃下继续延伸10分钟。 PCR反应包含的七种基本成分: 热稳定性DNA聚合酶:Taq DNA聚合酶是最常适用的酶,商品化Taq DNA酶的特异性活性约为80000单位/mg. 寡核苷酸引物:寡核苷酸引物的设计是影响PCR扩增反应的效率与特异性的关键因素。 脱氧核苷三磷酸(dNTP):标准的PCR反应体系应包括4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸,即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。每种dNTP的浓度一般在200-250μl之间,高浓度的dNTP对扩增反应会起抑制作用,可能是dNTP与Mg2+螯合有关。 二价阳离子:一般需要Mg2+来激活热稳定的DNA聚合酶,由于dNTP与寡聚核酸结Mg2+合,因而反应体系中阳离子的浓度一般要超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L。 维持PH值的缓冲液:用Tris-Cl在室温将PCR缓冲液的PH值调至8.3-8.8之间,标准PCR缓冲液浓度在10mmol/L。在72℃温育时,反应体系的温度将下降1个多单位,致使缓冲液的PH值接近7.2。 一价阳离子:标准PCR缓冲液内含有50mmol/L的KCl,它对扩增大于500bp长度的DNA是有益的。 模板DNA:含有靶序列的模板DNA可以以单链或双链形式加入到PCR混合液中,闭环DNA的及增效率略低于线性DNA。 学习PCR反应的基本原理和基本技术。 了解引物设计的一般要求。 二 、材料和试剂 10Х扩增缓冲液 4种dNTP贮存液(20mmol/L,PH 8.0) Tap DNA 聚合酶 5端引物(20μmol/L)及3端引物(20μmol/L) 模板DNA 琼脂糖凝胶 PCR仪(Bio-Rad公司) 移液枪(0.5-10μL 5-50μL) 枪头 微量移液管 实验操作 按照以下次序,将各成分加到微量离子管内混合: 10Х扩增缓冲液 2.5μl Mg2+ 1.5μl 5端引物 1μl 3端引物 1μl DDW 16.25μl dNTP 2.5μl Taq酶 0.25μl 模板 1μl 按照以下方法进行PCR扩增: 循环数 预变性 变性 复性 聚合 后延伸 35个循环 95 ℃ 5min 94℃ 1min 63℃ 1min 72℃ 1min 72℃ 10min 聚合反应时间是根据靶基因的长度按每分钟聚合1000bp的速率来计算出来的。 抽取每种扩增样品

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