分子生物学-工具酶.ppt

2、Taq DNA聚合酶(1)特性： ①耐热的DNA聚合酶来自于嗜热的栖热水生菌Thermus aquaticus 中纯化而来的。 ②5’?3’聚合酶活性  ③5’?3’外切酶活性 ④最佳作用温度为75-80?C （2）用途 ①通过PCR对DNA分子的特定序列进行体外扩增  ②对DNA进行测序 Pfu聚合酶，或Pfu酶，是在嗜热的古核生物火球菌属（Pyrococcus furiosis）内发现的。 与Taq DNA聚合酶不同，Pfu DNA聚合酶具有3‘-5’外切酶的即时校正活性，可以即时的识别并切除错配核苷酸； 保真性更高。 缺点：Pfu聚合酶的效率较低，般来说，在72℃扩增1kb的DNA时，每个循环需要1到2分钟，使用Pfu聚合酶进行PCR反应，产生钝性末端的PCR产物。 Pfu聚合酶常常用于保真性要求较高的DNA合成中。 合成的忠实性比Taq酶高12倍。 3、Pfu DNA聚合酶（Pfu DNA polymerase） 4.反转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶，RDDP）（1）特性①催化从RNA为模板的DNA聚合反应 ②具3’?5’RNA外切酶活性，能特异性降解RNA— DNA杂交分子中的RNA部分 ③具DNA指导的DNA聚合酶（DDDP）的功能 ④能以mRNA为模板催化合成出互补的DNA（cDNA） （2）分类 ①禽源反转录酶 来自禽或骨髓细胞瘤病毒（AMV）  具有聚合酶活性及强的RNA酶H活性  无3’?5’外切酶活性。 温度42?C  pH8.6时活性较高 ②鼠源反转录酶  来自Moloney鼠白血病病毒（M-MLV）具有聚合酶活性及相对较弱的RNA酶H活性 无3’?5’外切酶活性 温度37?C pH7.6时活性较高 5、末端脱氧核糖核酸转移酶（末端转移酶） 催化dNTP加到DNA分子的3’羟基端 3’末端标记 添加多聚体尾 催化双链DNA一端的3’OH与另一双链DNA 5’的磷酸根形成3’，5’-磷酸二酯键，使具有相同粘性末端或平末端的DNA末端连接起来。 （三）DNA连接酶（DNA Ligase） 3.特点： 催化DNA 5’磷酸基与3’羟基之间（切口）形成磷酸二酯键。切口(nick)：DNA分子糖-磷酸主键的破坏。缺口(gap)：DNA分子中核苷酸缺失。 2.分类： T4噬菌体DNA连接酶 大肠杆菌DNA连接酶  4.用途：①连接带匹配粘端的DNA分子，或钝性末端。②使平端的双链DNA分子互相连接或与合成、接头相连接。 （1）粘性末端连接 （2）平端连接5’ C G AOH pC G T A 3’3’ G C Tp OHG C A T 5’  ATP、Mg2+ T4连接酶 5’ CGACGTA 3’ 3’ GCTGCAT 5’ 四、碱性磷酸酶 alkaline phosphatase (AP) 1.特性： 催化去除DNA、RNA和dNTP的5’磷酸的反应。2.分类（1）细菌碱性磷酸酶（BAP)（2）牛小肠碱性磷酸酶（CIAP)3.用途（1）在用T4多核苷酸激酶和32P标记5’末端前，去除DNA或RNA的5’磷酸。（2）去除DNA片段5’磷酸以防止自身环化。 CIAP is most commonly used to remove 5-phosphates from vector DNA to prevent selfligation during cloning Eppendorf Tube Eppendorf Tube LOGO LOGO LOGO 分子生物学 李松 * * 一、限制性核酸内切酶（Restriction Enzyme） * 是一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶。 工具酶 1、限制性核酸内切酶的发现及其生物功能 识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链 主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵 细菌的限制与修饰作用 hsd R：编码限制性核酸内切酶 hsd M：编码限制性甲基化酶 hsd S：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达 1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出 Hind II和Hind III 2、限制性核酸内切酶的类型 主要特性 I 型 II 型 III 型 限制修饰 多功能 单功能 双功能 蛋白结构 异源三聚体 同源二聚体 异源二聚体 辅助因子 A