分子生物学常用技术原理.ppt

１Genetic engineering 重组DNA技术的发展史 1865年　G.J.Mendel的豌豆杂交试验 1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验 1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子 1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。 1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉 相关概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体 基本原理 重组DNA技术应用 二、工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 多核甘酸激酶等 此处是标题 wang home 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 （一）目的基因的制备 1. 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 2.基因组DNA文库(genomic DNA library) 3. cDNA文库(cDNA library) 4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 3. 基因重组与表达技术 蓝白斑筛选 α互补：laz’编码的α肽链；β半乳糖苷酶突变体 α-互补（α-complementation）： 在T-vector或 PUC质粒序列中，插入了lac启动子-操纵子基因序列以及编码β-半乳糖苷酶N-端145个氨基酸的核苷酸序列（又称α-肽）； 这类载体对应的宿主菌（如JM、DH5α系列）β-半乳糖苷酶基因失去了编码α-肽碱基序列 只有当这类载体引入到宿主菌后，载体上的β-半乳糖苷酶N-端片端才能与宿主菌的缺陷β-半乳糖苷酶互补，产生有活性的β-半乳糖苷酶，这种作用称为α-互补。 重组子鉴定 基因表达 选择表达系统 原核系统 真核酵母 动物细胞 植物细胞 亚克隆 一、定义 将克隆DNA片段从一个载体转移到另一个载体 二、应用 研究克隆DNA片段其中的一段序列克隆 DNA片段的表达 分子生物学常用技术 凝胶电泳(?) 分子杂交(?) 聚合酶链反应(PCR)技术(?) DNA的物理图谱 DNA序列测定 基因芯片 第一节 凝胶电泳(gel electrophoresis) 电泳概念 基本原理 Q μ＝ 6πrη μ: 迁移率 Q : 电荷量 r : 粒子半径（分子量） η: 介质粘度 电泳的用途 分离 鉴定纯度 测定分子量 凝胶电泳的种类 琼脂糖凝胶电泳(?) 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （一）分离核酸原理 电荷效应 分子筛效应 分子构象 1. 电荷效应 核酸是两性电解质 pH = 3.5 , 正电荷 pH = 8.0~8.3 , 负电荷，正极 2.分子筛效应 小分子移动快 ，大分子移动慢 3. 分子构象 闭环超螺旋线状DNA开环DNA （二）操作要点 支持物 凝胶浓度的选择 DNA分子量标准 电泳缓冲液 样品制备 电泳条件 DNA电泳染色 DNA片段的回收 1. 支持物 商品化的琼脂糖 琼脂糖种类 2. 凝胶浓度的选择 凝胶的制备 3. DNA marker DNA marker DNA 长度标准曲线 4. 电泳缓冲液 Tris-乙酸(TAE)pH 8.0 Tris-硼酸(TBE) pH 8.0 Tris-磷酸(TPE) pH 8.0 5. 样品制备 DNA 样品 每条带100ng 上样缓冲液 50%甘油/蔗糖 0.5%溴酚蓝/二甲苯青 点 样 6.电泳条件 潜水电泳 恒压电泳 低压: 1~2V/cm 中压: 8~10V/cm 高压：几十V/cm 温度：15~25℃ 潜水电泳 7.电泳染色 溴乙锭(ethidium bromide, EB) 结构及染色原理 染色方法 加入凝胶液中 电泳结束后染色 EB染色原理 紫外灯下显色 8. DNA片段的回收 低熔点琼脂糖法 透析袋电洗脱法(5kb) DEAE-纤维素膜法(0.5~5kb) （三）应用范围 DNA的分离、纯化和鉴定 限制性酶切图谱分析