噬菌体展示技术和其应用.ppt

非展示系统 展示系统 Phage structure. PIII, pVI, pVII, pVIII and pXIX representphage proteins. Exogenous peptides are expressed or “displayed” usuallyon pIII or pVIII. 抗体库技术简单流程 获得抗体基因 插入载体 表达 筛选 噬菌体展示技术的发展简史 1985年Smith — 证实噬菌体fd基因组能通过基因工程的手段进行改造[1]。 1988年Parmley — 将已知抗原决定簇与噬菌体PⅢ N端融合呈现在其表面[2]。 1990年McCafferty — 用噬菌体展示技术筛选溶菌酶的单链抗体成功使噬菌体展示技术进入一个广泛应用的时代[3]。 一系列噬菌体文库的构建—噬菌体展示技术焕发出了新的生命力。 噬菌体定义：是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒。 T7与M13相比优势明显 噬菌体cDNA展示技术 以改构的噬菌体为载体， cDNA基因片段定向插入 噬菌体外壳蛋白基因区， 使外源蛋白表达并展示 于噬菌体表面， 通过亲和富集法筛选 表达有特异蛋白质的噬菌体。 噬菌体cDNA展示技术的应用 1 用于模拟表位的研究。 2 用于DNA、RNA结合蛋白的研究。 3 用于蛋白-蛋白相互作用的研究。 4 用于非蛋白小分子与蛋白相互作用的研究。 5 细胞与蛋白相互作用的研究。 6 酶作用底物的分析、先导化合物的发现、定位信号转导途径等。 问题 1. 没有一个系统能够表达所有的真核细胞蛋白。 2. 在外源cDNA插入噬菌体载体时存在双向插入，可能导致表达减少或者逆向表达。 展望 噬菌体cDNA展示技术有效地实现了基因型和表现型的转换，在分子克隆的基础上，实现蛋白质构想的体外控制，从而可获得具有生物学活性的表达产物。若将其与蛋白质三维结构预测、分子模拟技术完美融合，对分子相互作用、分子识别、受体识别、酶学机制等研究进程将起到极大的推动作用。 应用举例： 部分做过的工作 一、半合成噬菌体抗体库的构建 构建一个半合成抗体库，不经免疫制备人源抗Tie2 Fab抗体。通过RT-PCR方法，从人脐带血淋巴细胞总RNA 扩增轻链基因及重链VH段基因，将轻链基因插入pCOMb3载体中，得人轻链质粒库；从乙肝表面抗体（HBsAb）的Fd段基因制备含有不同长度随机化CDR3的FR3-CDR3-J-CH1片段，然后将VH段基因与随机化的CDR3融合，得到Fd基因片段，再将其插入轻链质粒库中，得半合成人Fab质粒库。 材料和方法 人脐带血淋巴细胞 Ficoll–paque plus购自Pharmacia公司。 Trizol试剂购自Invitrogen 公司。 pComb3噬菌体抗体表达载体：4029bp，含有可插入轻链和重链基因的克隆位点。 大肠杆菌XLl-blue 辅助病毒VCSM13 cDNA制备 引物设计 电转化感受态的制备 辅助噬菌体的制备 抗体库制备 结果 PCR扩增人抗体基因 图3.4 重链重叠PCR扩增结果 1－3泳道： CDR3-5+(H135，H2，H4) 融合结果 4－6泳道： CDR3-8+(H135，H2，H4) 融合结果 7－9泳道： CDR3-10+(H135，H2，H4) 融合结果 10－12泳道：CDR3-12+(H135，H2，H4) 融合结果 图3.5轻链和重链插入pComb3 流程 人源轻链抗体文库的构建 经限制性内切酶SacI和XbaI 双酶切的人抗体轻链PCR产物与用相同内切酶酶切、去磷酸化的pComb3载体，16℃连接，用该连接产物进行电转化，根据1μl和10μl菌液铺平板所长出来的菌落数，可推算出人抗体轻链文库的库容量。 κ链文库的容量为5.03×106,λ链文库的容量为6.8×106(多次建库混合后的库容量)。 从平板上随机挑取10个菌落，涂格，过夜培养，菌落PCR鉴定。对于λ链文库，10个克隆中有6个阳性，λ链文库的插入率大约为60％；κ链文库10个克隆中有7个是阳性，其插入率大约为70％。 人源噬菌体Fab抗体半合成文库的构建 将酶切纯化的重链重叠PCR产物插入经酶切、并切胶回收纯化的轻链抗体文库中，转化感受态细胞，在辅助噬菌体VCSM13的超感染下，繁殖出表达人抗体Fab段的噬菌体