基 因 载 体.ppt

* 基 因 载 体 质粒(plasmid ) 独立于染色体, 能自主复制的共价、闭合、环状双链DNA分子(covalently closed circular DNA, cccDNA)。 Plasmids are best thought of as mini-chromosomes. Plasmids are composed of DNA which usually exists as a circular molecule, only much SMALLER than the genomic DNA . 1．大小：1 -- 200 kb，106~108dal。 2．占细菌总DNA的1~2%。 3．编码一些重要的非染色体控制的遗传性状。 4．游离状态，可整合到染色体上。 质粒的生物学特性 例如，细菌中许多质粒带有抗药性基因，如编码合成能分解破坏四环素、氯霉素、氨芐青霉素等的酶基因，这种质粒称为抗药性质粒，又称R质粒。 质粒对宿主生存并不是必需的 线粒体DNA也是环状双链分子，也有独立复制的调控，但线粒体的功能是细胞生存所必需的，线粒体是细胞的一部分。 质粒有其表型，其表现不是宿主生存所必需的，但也不妨碍宿主的生存。某些质粒携带的基因功能有利于宿主细胞的特定条件下生存。 质粒的基本特性 质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori）及一个控制质粒拷贝数的基因，能独立于宿主细胞的染色体DNA自主复制，且不同的质粒在宿主细胞内的拷贝数也不同。 1. 自主复制性 利用同一复制系统的不同质粒如果被导入同 一细胞中，在复制及随后分配到子细胞的过程中，拷贝多的复制更快，在细菌繁殖几代之后，细菌的子细胞中绝大多数都含有占优势的质粒，因而这两种质粒中只能有一种长期稳定地留在细胞中。 2. 不相容性 高拷贝数的质粒，每个寄主细胞中可高达10一60份拷贝，这类质粒被称为“松弛型”复制控制的质粒(relaxed plasmid)。 低拷贝数的质粒，每个寄主细胞中仅台有1—3份拷贝，这类质粒为“严紧型”复制控制的质粒(stringent plasmid) 根据寄主细胞所含的拷贝数的多少 ◆ ◆ 3. 可扩增性 天然条件下，很多质粒通过细菌结合作用在二个宿主细胞内交流，这种转移依赖于质粒上的接合基因产物。 在基因工程实验室中用的质粒均缺少此基因。保证质粒不会扩散污染自然环境。 4. 可转移性 天然质粒上携带许多功能基因，可用作选择标记。--抗菌素抗性基因--重金属离子抗性基因--复杂有机物的分解基因 5. 携带遗传标记 1．接合型和非接合型（细胞间自我转移） 2．严紧型和松驰型（质粒的拷贝数） 3．窄宿主范围和广宿主范围（复制起始点特异性） 4．F质粒、R质粒、Col质粒（使宿主细胞获得某一特定性状） 质粒的分类 Col质粒//产大肠杆菌素因子。编码有大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌素是一类可使不带有Co1质粒的亲绿关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。 F质粒//F因子/性质粒。能使寄主染色体上基因和 F质粒转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。 R质粒//抗药性因子。编码一种或数种抗菌素抗性基因，能使此种抗性转移到缺乏该质粒的的受体细胞，使获得同样的抗菌素抗性能力。 质粒的命名 p小写代表质粒；后有两至三个大写字母代表发现者或构建者的姓名。 质粒的构建 天然存在的两种质粒，人工构建的质粒大都来自它们 （1）ColE1 宿主细菌：大肠杆菌 松弛型复制 20-30/cell （2）pSC101 宿主细菌：沙门氏菌 严谨型复制 5 /cell （1）加入合适的选择标记基因 ?  （2）增加或减少合适的酶切位点 ? （3）切去不必要的片段，增加装载量 ? （4）改变复制子，变严紧为松弛? （5）加装特殊的基因元件 质粒人工构建 方法就是重组，拼拼接接，挖肉补疮 实验室常用的质粒载体 (人工构建的质粒) 多拷贝 松弛型复制 大肠杆菌型质粒四环素抗性基因（Tetr）氨苄青霉素抗性基因（Ampr） pBR322 pUC质粒系列 pUC质粒系列在pBR322基础上改建。 含有pBR322大部分包括完整的ampr基因和复制起始点。去除pBR322的tetr区段，换用M13噬菌体的476bp片段，含LacZ’基因及其启动子的操纵基因、M13的多聚接头polylinker.