基因工程课件2-4章.ppt

* * 第 六 节 植 物 克 隆 载 体 一、Ti质粒载体 1. 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)与Ti质粒 G-菌，可侵入90科双子叶植物受伤组织，形成冠瘿瘤(crown gall tumor)。冠瘿瘤细胞具有以下特征： i. 不需要补充植物激素便可进行离体培养 ii.合成肿瘤特有的化合物—冠瘿碱(opine)，能专一 的为根癌农杆菌所利用. 这两个特征由Ti质粒决定，但该质粒中仅有一部分进入植物细胞。 1) Ti 质粒类型（由Ti 质粒所产生的冠瘿碱种类而定） i. 鱆鱼碱类(octopine) ii. 胭脂碱类(nopaline) iii.农碱类(agropine) 2) Ti 质粒的结构 i. 环状ds-DNA,160-250kb，具六个功能区 i) 致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素 ii) 冠瘿碱合成区：参与冠瘿碱合成 iii) 冠瘿碱分解区：参与冠瘿碱分解 iv) Ti 质粒转移区(tra)：参与不同农杆菌中的接合转移 v) 毒（性）区：参与T-DNA的转移和插入植物染色体 vi) DNA复制区：参与Ti 质粒DNA复制 Ti质粒的结构 ii. T-DNA T-DNA包括植物激素冠瘿碱合成区基因及两侧相同的25 bp重复序列，T-DNA整合不具特异性，右侧25 bp重复序列对T-DNA的转移至关重要。 不同Ti 质粒中的T-DNA结构是不相同的，其中 i) 胭脂碱Ti 质粒的T-DNA长23bp,结构连续，具13个基因 ??? ii) 鱆鱼碱Ti 质粒中的T-DNA不连续，分左右两段，分别称之为TL和TR, TLDNA长13.2 kb,含8个基因，包括鱆鱼碱合成酶和植物激素合成基因, TR –DNA长7.9 kb，含5个基因，参与甘露碱(mannopine)和农碱合成 iii)两者同源性：主要集中在植物激素合成区。 Ti质粒的T-DNA的同源性 2. Ti质粒载体 1) Ti质粒作为载体的问题 ??????? i) 太大，无适合克隆位点 ???????ii)T-DNA的存在不能使转化细胞再生为完整植株 2) 载体类型 i)中间载体(intermediate vector) 由以下几部分组成： ?适合于E.coli和A.tumefaciens自主复制和选择用标记基因 ?适合于植物细胞选择用标记基因 ?一段来自天然Ti质粒的部分T-DNA序列（提供同源重组） ?1-2个来自T-DNA的25bp重复序列 ?用于表达外源基因的DNA序列（如启动子、终止子序列） 重组DNA的转移过程： 中间载体或重组子 E.coli(中宿主) A.tumefaciens ? 在根癌农杆菌中与天然Ti质粒或非致瘤质粒发生共整合作用 感染植物受伤组织或与植物细胞共培养 T-DNA进入植物细胞并整合到染色体DNA中 外源基因表达 转化 接合 转移 根癌农杆菌中Ti质粒的转移 Ti载体的共整合作用 Ti质粒衍生的植物克隆载体 非致瘤载体的重组 ii)非致瘤Ti质粒载体(disarmed Ti plasmid) 该类载体实际上是辅助载体，其特点是用pBR322 DNA取代了Ti质粒中参与植物激素合成基因序列，它可以与含有pBR322 序列的DNA发生同源重组，构成一个完整的重组DNA序列，然后转移至植物细胞。 如果在中间载体中插入一个T-DNA的25bp重复序列，在非致瘤Ti质粒载体中插入另一个25bp重复序列，经重组后形成一个完整的T-DNA，这种系统称之为分离末端载体系统(SEV,Split End Vector)。 iii)双末端载体(binary vector) 该类载体的显著特点是含有两个T-DNA末端，所有需要转移到植物细胞中去的序列都位于其间。 分离末端载体的共整合作用(SEV) 例子: pBIN19的结构 T-DNA的转移必须依赖于辅助质粒，pAL4404就是一个T-DNA全部丢失的天然缺失突变体。转移过程： pBIN19 E.coli A.tumefaciens T-DNA进入植物细胞 该系统的最终转化频率比SEV系统高得多 3）标