基因组提取 16S RNA PCR及连接转化.doc

一、实验材料 菌种：某浸矿混合菌。 设备：eppendorf管、移液枪、台式高速离心机、电泳仪、水浴锅、PCR仪、无菌操作台、牙签、枪头、酒精灯。 试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒、LB液体培养基、LB固体平板培养基、TE缓冲液（pH 8.0）、切胶回收试剂盒、Taq DNA polymerase，10 mM dNTPmix，引物，双蒸水，琼脂糖、溴乙锭EB、电泳缓冲液（50×TAE电泳缓冲液：取Tris 24.2g，冰醋酸5.7ml，0.25mol/L EDTA（pH8.0） 20ml，加蒸馏水至100ml）、pGM-T 克隆试剂盒、Hind III、石蜡。 二、实验步骤 1 细菌基因组DNA提取 1.1 样品收集 菌种培养至OD600为1-1.5，此时1 mL 菌液中约含1.0×109细胞，用灭过菌的1.5mL离心管去菌液1 ml，室温10,000 rpm离心1 min，收集菌体。 1.2 基因组DNA的提取 （使用前先在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积参照瓶上的使用说明。） 1.向菌体沉淀中加入200 μl 缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮； 2.向管中加入20 μl 蛋白酶K溶液，混匀； 3.加入220 μl 缓冲液GB，振荡15秒，70℃放置10 min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；若溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯； 4.加入无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠； 5.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中； 6.向吸附柱CB3中加入500 μl 缓冲液GD，12,000 rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3 放入收集管中； 7.向吸附柱CB3中加入700 μl 漂洗液PW，12,000 rpm 离心30秒，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中； 8.向吸附柱CB3中加入500 μl 漂洗液PW，12,000 rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中； 9.将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液； 10.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200 μl 洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000 rpm 离心2分钟，将溶液收集到离心管中。为了增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2分钟，12,000 rpm离心2分钟。洗脱缓冲液体积不应少于50 μl，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证pH值在7.0-8.5范围内（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0会降低洗脱效率，且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。 1.3 DNA检测 配置0.8%的琼脂糖凝胶，点样5μl ,约80V 电泳20-30分钟，置于凝胶成像系统或紫外投射检测仪上观察条带。具体步骤如下： 1制胶（80ml）：称取0.64g琼脂糖，加入80ml 的1×TAE缓冲液（pH8.0），摇匀；微波炉加热，至琼脂糖完全溶解（要防止过热溢出三角瓶）；将胶板放入制胶槽中，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）加入5.0 μl EB 后，混均匀，倒入其中，直至厚度为4-6mm（如有气泡要把气泡赶出），在室温下冷却凝固（约30-45min）。将制胶板置于电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。 2 点样：用微量移液器将5μl含蓝色染液的Marker加入点样孔下部，样品与Loading Buffer混匀后进行点样。 3 电泳：打开电源开关，调节电压至3-5V/cm(约80V)，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约20-30min后即可观察结果。 4 观察：将电泳好的胶置于紫外投射检测仪上，打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带，根据条带粗细，可粗略估计该样品DNA的浓度。 2 16s rDNA PCR扩增 1 在冰盒上操作，按从大体积到小体积的次序将各成分加入一无菌PCR管中。 试剂 体积/μl 10×PCR Buffer 2.5 dNTPs 1 引物1 0.5 引物2 0.5 DNA模板 2 Taq 酶（2U/μl 1 dd H2O 15.5 Mgcl2 2 2 调整好反应程序，将上述混合液混匀，立即置PCR仪上，