Miseq标准化操作指南中文翻译版.pdf

浓度质控 目的基因DNA 纯化目的DNA 第一次PCR 扩 Miseq 操作 50ng 的基因组 片段化 RSP、SPB 增 index1 、 简单流程： DNA，浓度 SPB、ST、TD、 板NLA index2、NLM 5ng/μL 板TDE 板NLA 深孔板NLT 第一次PCR 扩 第一次杂交 首次捕获 第二次杂交 第二次捕获 增产物纯化 CSO、EHB EE1、ET2、EWS、 CSO、EHB、RSB EE1、ET2、EWS、 RSP、SPB 板NLA HP3、SMB 板NEH2 HP3、SMB 板NLC、NLS 板NEW1、NEH2 板NEC1、NEW2 捕获样品纯化 第二次PCR 扩 第二次PCR 扩 RSP、SPB 增 增产物纯化 文库验证（生 上级测序 板NEA NEM、PPC RSP、SPB 物分析仪） 数据分析 板NEA 板NEC2、NES Qubit2.0 可测范围0.2-100ng （一）控制浓度 1. 反应液（199L ）+染料（1L ）——每个管中。 注意：反应液常温避光保存；标准品避光4℃保存。 2. 取1.5mL 的干净离心管： 反应液190μL+标准品（红管）10μL………标记为① 反应液190μL+标准品（黄管）10μL………标记为② 反应液190μL+样品Ⅰ10μL………………… 标记为③ 反应液190μL+样品Ⅱ10μL………………… 标记为④ ………………………. 漩涡振荡2-3s，静置反应2min 【注意避光！】 3. 用 Qubit2.0 测样本浓度，测前排净管中气泡，每 1-2 周用标准品校准仪器。 （可测两遍核对） 4. 每个样品用10mM 的Tris-HCl （pH8.5 ）稀释到5ng/μL，取10μL 备用。 5. 漩涡振荡混匀，室温放置，得到gDNA 。 (二) DNA 片段化 准备 DNA 缓冲液Tagment DNA Buffer (TD) DNA 酶1 Tagment DNA Enzyme (TDE1) 目的DNA 转移到冰上。缓冲液颠倒混匀、酶不适合旋涡，易损坏酶片段。  把样本纯化磁珠从2-8 度冰箱取出，至温度升到室温。  确保终止连接缓冲液（ST）没有沉淀，如有沉淀要旋涡，直到所有颗粒物悬 浮起来。  多试剂处理，使用排枪，分装洗脱缓冲液，目的DNA 缓冲液，和DNA 酶， 分装到八连排管中，保证每个孔的体积一致。把样品纯化磁珠倾倒至多通 道反应管中。  将深孔板插入到加热体模块中，预加热垂直混匀仪至58 度。  取一个深孔板，用记号笔签字。 操作 确保反应试剂分装时，为了最好的描述试剂盒信息，反应液分装不需要再冰 上操作。 1. 按照以下步骤标准化 a) 检测目的DNA 样本的质量，使用紫外分光光度计或者Qubit， b) 每个样品用10mM 的Tris-HCl （pH8.5 ）稀释到10ng/μL。。 c) 再次检测5ng/μL 的目的DNA 样本质量，使用紫外分光光度计或者Qubit 。 d) 在此基础上，每个样品用10mM 的Tris-HCl （pH8.5 ）稀释到5ng/μL，取10μL 备用。配置方法：原DNA 浓度为18 ng/