海南黄牛外周血白细胞cDNA文库的构建.pdfVIP

第 13卷 第 4期 华 南 热 带 农 业 大 学 学 报 2oo7年 12月 Vo1．1 3 No．4 J0URNAL OF SOUTH CHINA UNⅣERSITY OF 玎 0PICAL AGRICULTURE Dec．2Oo7 海南黄牛外周血白细胞cDNA文库的构建 杜 丽 刘 涛1 申明霞 ，2 王凤阳 成 鹰1 张莉娜 祁 超 李治深1 吴科榜1 张 艳 许兆艳 林杰材 满初日嘎 f1海 南 大 学 农 学 院 海 口 570228； 2华中师范大学生命科学学院 武 汉 430079) 摘要 运用S~IART(Switching MechaniSnl at 5’end of RNA Transcript)技术构建海南黄牛外周血白细胞cDNA 文库。采用RNAiSO Reagent处理新鲜血液，以总RNA抽提试剂盒(上海华舜)制备总RNA。用Powerscript 反 转录酶逆转录合成第一链cDNA，LD—PeR扩增获得eDNA双链， I酶切和CHROMA SPIN一400 柱分离后，500 bp 以上的片段与pDNR—LIB载体连接，电转化人 ．DH5ct。建成原始文库。经鉴定，库容量达到 1．2×10e克隆， 原始文库滴度为 3×10。cfu／mL，扩增后的文库滴度为4．3×10 cfu【／mL。PCR鉴定重组子，发现重组率接近 100％，插入片段大小分布为0．5～2 kb．插入片段平均长度约为1 kb。文库的各项指标均达要求，为利用文库筛 选海南黄牛已知和未知功能基因提供了材料来源，且为进一步研究基因的结构和功能奠定了重要基础。 关键词 海南黄牛 cDNA文库 S姒RT技术 外周血白细胞 中图分类号 S823 随着集约化高密度饲养方式的迅速发展．畜牧 Clontech公司的 SMART(switching mechansm at 业生产越来越迫切要求缓解夏季高温对猪、禽、奶 5 end of RNA transcript)技术成功地构建了海南 牛业带来的环境压力，降低因热应激导致的生产动 黄牛外周血自细胞eDNA文库，为后续的海南黄牛 物的生产性能下降所造成的巨大经济损失。因此． 功能基因研究奠定了基础。 对动物耐热性状的研究具有重要的理论意义和实际 应用价值。 l 材料与方法 海南岛地处热带，其特殊的自然环境和气候孕 1．1 材料 育了独特的动物基因资源。海南黄牛的耐热、抗热 海南黄牛新鲜血液采白海南大学秀英农场。 性状的形成是其在长期的进化过程中自身基因突变 RNAiSO Reagent购自TaKaRa公司．血液总RNA抽 与海南岛地处热带环境的自然选择相互作用的结 提试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。文库构 果，具有很高的研究价值。 以往对动物适应热带气 建试剂盒Creator删SMAR eDNA购自Clontech公 候的机制，主要从器官、组织及细胞水平上进行研 司，宿主菌株E．coli DH50【购自大连宝生物公司。 究，对遗传与环境因素作用的研究很少。理想的 eDNA合成引物(均由试剂盒提供)：(1)eDNA合成第 eDNA文库可以忠实完整地代表所制备组织中所有的 一 链 引 物 CDS III／3 PCR Primer：5 -ATTCT mRNA分子，而且，eDNA便于克隆和大量表达。所 AGAGGCCGAGGCGGCCGACATGd一(T)∞N～lN_3 (N=A，G，C 以，eDNA文库是发现新基因和研究基因功能的重 或T；N-I=A