猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立及应用.pdfVIP

· 44· Animal HusbandryVeterinary Medicine 2007 Vo1．39 No．10 猪圆环病毒2型PCR检测 方法的建立及应用 陈伟杰 ，徐 辉h，赵灵燕 ，项林和 ， 倪柏锋 ，周彩琴 ，吴赘 (1．浙江省畜牧兽医局，浙江杭州 310020； 2．浙江省云和县农业局，浙江云和 323600) 摘要：根据GenBark中登录的猪圆环病毒2型基因序列，应用Primer Premier5．0设计筛选一对扩增ORF2基因引物，建立从猪病料中直接检测 PcV2感染的PCR方法b扩增PcV2阳性样品出现一条447 bp的特异性DNA条带，扩增产物测序结果证实为PcV2 ORF2基因序列。应用本方法扩 增猪瘟病毒 (HCV)、猪繁殖与障碍综合征病毒 (PRRSV)、猪伪狂犬病毒 (PRV)、猪细小病毒 (PPV)等常见猪病原均未出现特异性条带，表 明方法特异；敏感性试验结果表明，样品DNA模板检测浓度可达到9．8×10一rig／ILL；重复性和稳定性试验结果表明，用本试验建立的PCR方法 进行PcV2检测，结果稳定可靠。经病猪临床检测应用，在66份病猪样本中，PCV2感染阳性率为27．27％，且多与PRRSV、PRV、HCV、PPV等 一 种或多种病毒混合感染，混合感染比例达72．22％。 关键词：猪圆环病毒2型；PCR；检测；诊断 中图分类号：$858．283 文献标识码：B 文章编号：0529 5130(2007)10．0044—03 猪圆环病毒感染 (Porcine circovirus infection，PCI)是由 疫苗毒。猪瘟疫苗毒来自南京生物药厂，猪蓝耳病疫苗毒来自 猪圆环病毒 (Porcine eircovirus，PCV)感染引起的以免疫抑制 上海佳牧生物制品有限公司，猪细小病毒疫苗毒来自北京中海 为主要特征的一类猪传染病，其主要临床表现为断奶猪多系统 保健科技公司，猪伪狂犬疫苗毒来自中牧实业股份有限公司。 衰弱综合征 (PMWS)、猪皮炎和肾病综合征 (PDNS)、新生 1．2 主要仪器及试剂 仔猪先天性颤抖病等。根据致病性和序列分析，PCV可分为 主要仪器：Biometra UNO II PCR仪，Eppendod BioPhotom- PCV1和PcV2两个血清型，但PCV1无致病性，广泛存在于猪 eter核酸蛋白测定仪。BIO—RAD Gel Doc TM 2OOO凝胶成像 群中；Pcv2具有致病性，能引起多种疾病综合征，已严重影 系统。 响到养猪生产 “J。PCV2致病的主要原因是通过病毒感染引 主要试剂：DNeasy Tissue Kit(德国Qiagen公司生产)； 起猪免疫抑制或免疫力下降，导致对其他病的免疫和治疗效果 TRhol Reagent(Invitrogen公司生产)；rTaq DNA聚合酶、 下降 J。临床上由于混合感染，病猪死亡率大大增加，病死 dNTPs、RNA PCR Kit(AMV)、DL 2000 marker(TaKaRa公司 率可达70％以上，僵猪数量明显增多。 生产)，其他试剂均为国产分析纯。 目前我国对Pcv2诊断方法主要有酶联免疫吸附试验、聚 1．3 引物的设计与合成 合酶链式反应 (PCR)。在实际应用中，笔者曾对我国不同厂 针对GenBank中已登录的PCV2 ORF2基因序列，用 阶 家生产的PCV2酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒进行对比试 er Premier 5．0软件设计PCV2 ORF2保守序列的引物，引物由 验，发现结果差别较大，用ELISA检测PCv2抗体方法很难对 上海生工生物工程有限公司合成，用灭菌超纯水稀释成 病猪进行确诊。本研究根据PCR技术原理，建立了PCv2的