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右美沙芬对激活的小胶质细胞的抑制作用 　　（1.宁夏颅脑疾病重点实验室，宁夏医科大学，宁夏 银川 750004；2.银川市第一人民医院，宁夏 银川 750004） 　　摘要：目的：研究右美沙芬（DM）对激活的小胶质细胞的作用及热休克蛋白60（HSP60）在DM神经保护中的作用机制。方法：培养BV2小胶质细胞株，分为对照组，细菌脂多糖组，（LPS），实验组（DM）。Western-blot检测DM对LPS激活的BV2细胞HSP60和Caspase 3的影响，ELISA检测DM对HSP60释放的作用。结果：LPS组中HSP60和Caspase 3的表达及释放都比对照组显著增加，加入DM后，这些因子的水平都明显降低。结论：DM可能通过HSP60信号通路途径阻止小胶质细胞的凋亡而发挥神经保护作用。 　　关键词：热休克蛋白60；右美沙芬；Caspase 3；小胶质细胞 　　中图分类号：G642.423 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2017）18-0277-02 　　热休克蛋白是机体的一类应激蛋白，在生理状态下对机体起着保护功能。但是有研究发现，在病理情况下，很多细胞会大量表达热休克蛋白60（HSP60），并将其释放到胞外，引起细胞凋亡[1]。右美沙芬（Dextromethorphan，DM）是一种右旋吗啡喃化合物[2]，对动物因低血糖或脑缺血引起的神经损伤具有保护作用，DM被证明能有效抑制小胶质细胞活化，并且可抑制细胞炎症因子如TNF-α、IL-6，NO和超氧化自由基等[3]，但是右美沙芬的作用机制目前尚不清楚。 　　一、材料与方法 　　（一）材料 　　右美沙芬和LPS购自Sigma公司；HSP60抗体购自ENZO公司；Caspase 3及β-actin抗体购自Cell Signaling公司；蛋白定量BCA试剂盒购自Thermo公司；ELISA试剂盒购自欣博盛公司。 　　（二）方法 　　1.小胶质细胞BV2的培?B。BV2细胞培养在DEME培养基中，含10%胎牛血清。利用1μg/ml LPS处理30min后，在细胞培养液中加入DM溶液（10μM），作用24小时后收集细胞及上清。 　　2.Western blot检测蛋白含量。药物处理完毕，提取各实验组的蛋白并收集上清液，10% SDS分离后转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭膜2小时。然后加入一抗，置于4℃过夜。利用TBST洗涤膜三次，洗去未结合的一抗。最后用二抗室温孵育1 h，利用ECL试剂显色成像。 　　3.ELISA试剂盒检测HSP60的释放。按照HSP60 ELISA试剂盒操作说明进行实验，最后酶标板置于酶标仪上，450nm处测定各孔光密度值（OD）。 　　4.统计学分析。采用SPSS11.11进行统计学分析。实验数据用x±s表示，组间比较用方差分析，进一步比较两两间差异采用Student-Neuman-Keuls Test方法。 　　二、结果 　　（一）DM显著抑制LPS激活的小胶质细胞HSP60的表达及释放 　　LPS激活后的小胶质细胞中HSP60的表达明显高于对照组，差异具有显著性。加入DM可显著抑制LPS引起的HSP60的升高，差异具有统计学意义（P0.05）。对上清液进行ELISA实验，结果显示DM处理后，LPS引起的小胶质细胞HSP60的胞外释放量明显地被抑制了。 　　（二）DM抑制Caspase 3的表达 　　Western blot结果表明，LPS激活的小胶质细胞中Caspase 3的表达明显高于对照组，在DM处理的实验组中，Caspase 3的表达显著下降，差别有统计学意义（P0.05）。 　　三、讨论 　　热休克蛋白是一类应激蛋白，对机体主要起着保护作用。但是HSP60对细胞凋亡具有双重作用。我们先前的研究发现心肌细胞中HSP60的表达和定位都发生了改变，导致心肌细胞的损伤或凋亡[4]。但是关于HSP60在神经系统中的作用的报道还很少见。 　　小胶质细胞的激活参与了多种神经系统退行性病变如老年痴呆症、帕金森症等的发生发展[5]。本研究假设HSP60在激活的小胶质细胞中高度表达，并被释放至胞外。胞外的HSP60激活凋亡因子Caspase 3，导致周围其他神经细胞的损伤或凋亡。本实验证实了在LPS激活的小胶质细胞内HSP60的表达显著增高，胞外也检测到HSP60，并增强了Caspase 3的表达。这些结果与心肌细胞中关于HSP60的研究结果的报道一致，说明小胶质细胞活化后释放至胞外的HSP60可进一步激活自身导致自身的凋亡。 　　右美沙芬可能是一种潜在的治疗神经系统炎性疾病的药物[6]。本实验中，我们证实了DM能有效抑制小胶质细胞的激活，为一些神经退行性疾病的防治提供了潜在的药物治疗靶点。 　　参考文