掌握简单染色法和革兰氏染色法的原理及操作步骤.PPT

实验一 细菌的形态结构观察和染色 目 的 要 求 观察细菌菌落的特征。 掌握简单染色法和革兰氏染色法的原理及操作步骤。 在油镜下观察细菌个体的形态。 了解几种细菌的特殊染色方法，包括芽孢、荚膜及鞭毛染色。 了解环境微生物的检查。 奥林帕斯(OLYMPUS)双筒生物显微镜 奥林帕斯生物显微镜的使用方法 接通电源。 打开主开关。 转动光强调节钮，使亮度适中。 把标本固定在载物台上。 用低倍物镜，旋转粗调和微调来进行对焦。 调节双目镜筒间距和视度差。 再适当调节照明度。 使焦点正确地对准标本。 调节孔径光阑。 依次用低、中、高倍镜观察。 油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，下降载物台，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，再细调至看清物象为止。 换片：另换新片，必须从第9条开始操作。 观察完毕，下降载物台，取下载物台上的载玻片，将4×的目镜对准载物台，再用擦镜纸擦去镜头上的油，然后用擦镜纸沾取少量乙醇/水擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的乙醇/水。 用毕复原：先将电压调节旋钮复原，关闭主开关，切断电源。 显微镜保养和使用中的注意事项 不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度。 观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。 光强要适中，太亮不仅损伤灯泡寿命，也对眼睛有一定的伤害，并且无法进行图像采集。 观察时，两眼睁开，养成能够用两眼观察的习惯，使两眼同时聚焦。 观察临时制片时，不要让玻片中的水分流到载物台上，更不能使酸、碱及其它化学药品与显微镜接触。 油镜使用的原理 油镜，即油浸接物镜。 当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。 若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。 基 本 原 理 (一)简单染色法原理 (二)革兰氏染色法原理 (三)抗酸染色原理 (四)芽孢染色原理 (五)荚膜染色原理 (六)鞭毛染色原理 染色剂和染色原理 微生物染色常用染料如下表： 实验内容（简单染色的方法和步骤） 实验内容（革兰氏染色的方法和步骤） 实验内容（了解抗酸染色的方法和步骤） 1．制片 将少量草分枝杆菌制成菌悬液，80℃恒温水浴3h杀死菌体。取菌悬液涂片，自然干燥。 2．染色 滴加石炭酸复红染液2滴，覆盖涂片，在微火上加热至有蒸气出现，不断补充染液，加热8～10min，弃染液。 3．脱色 用3％盐酸乙醇液脱色，至乙醇液呈淡红色或无色。 4．水洗 滴加蒸馏水洗去盐酸乙醇。 5．复染 加美蓝染液染lmin。 6．水洗后自然干燥、镜检 草分枝杆菌呈现红色。若用非抗酸性菌作为对照，则菌体被染成蓝色。 实验内容（了解芽孢染色的方法和步骤） 孔雀绿染色法：取一干净载片，在载片中央加一小滴水，按无菌操作取巨大芽孢杆菌菌体少许混合均匀，制成涂片，风干固定后，在涂菌处滴加7.6％的孔雀绿饱和水溶液，间断加热染色10min后(注意添加染液勿使涂片干燥)，用水冲洗。再用0.5％蕃红液染色lmin，水洗，自然干燥后镜检。芽孢被染上绿色，营养体呈现红色。 实验内容（了解荚膜染色的方法和步骤） 1．制片 加一滴6％葡萄糖水溶液于载片一端，挑取少量胶质芽孢杆菌与其混合，再加一滴黑色素充分混匀。用推片法制片，将菌液铺成薄层，自然干燥。 2．固定 滴加l～2滴无水乙醇覆盖涂片，固定lmin，自然干燥。 3．染色，冲洗 滴加结晶紫，染色2min，用水轻轻冲洗，干燥后镜检。 有荚膜的菌、菌体呈紫色，背景灰黑色，荚膜不着色呈无色透明圈。无荚膜的菌，由于干燥菌体收缩，菌体四周也可能出现一圈狭窄的不着色环，但这不是荚膜，荚膜不着色的部分宽。 实验内容（了解鞭毛染色的方法和步骤） 1．载片的清洗：将载片洗净浸泡在95％乙醇中备用。 2．实验菌种的准备：将枯草芽孢杆菌在新制备的肉膏蛋白胨斜面培养基上(斜面下部要有少量冷凝水)，连续移种3～4次，每次培养12～18h，最后一次培养12～16h。 3．制片：擦干载片，在载片一端加一滴蒸馏水，用接种环挑取少许菌苔底部有水部分的菌体(注意不要挑出培养基)，将接种环悬放在水滴中片刻，将载片稍倾斜，使菌液随水滴缓缓流到另一端，可再返转一次使菌液流经面积扩大，然后放平，自然干燥。 4．染色（利夫森氏染色法） ：用蜡笔将涂菌区圈起，滴加染液，过数分钟后，当染液的1/2以上区域表面出现金属光泽膜时，用水轻轻将金属膜及染液冲洗干净，自然干燥。 镜检镜检时应在涂片上