氯通道的电生理研究.ppt

CFTR 的拓扑结构 Transmembrane Regions (TMs) 1 12 N C NBD1 NBD2 R Domain ATP ATP PKA (PKC) Out In NBD结构域：ATP结合（gating） R结构域：磷酸化（PKA和PKC） 孔道区 CFTR 的功能结构域 Single channel Macroscopic Current Recording How does this make a channel? How does Cl get through? ? 研究手段 ---- DNA重组技术与膜片钳技术的结合 pIRES/CFTR WT DNA（extracted from E. Coli） Mutagenesis (PCR) Transfect (BHK cells) Patch clamp (compare WT and mutant) WT^R303Q/A/E/K, WT^K95Q, etc Patch Clamp Recording of CFTR Channel Currents Inward rectification Outward rectification K95Q Wild Macroscopic Current Recording ([Cl-]o = [Cl-]i = 154 mM) R334E 非极性中性氨基酸： 丙氨酸（A）等 极性中性氨基酸： 谷氨酰胺（Q）、半胱氨酸（C）等 碱性氨基酸： 赖氨酸（K） 、精氨酸（R） 、组氨酸（H） 酸性氨基酸： 谷氨酸（E）、天门冬氨酸（D） 氨基酸分类 CFTR一级结构模式图 不同位点突变后对氯电流的影响 突变为中性 或 酸性氨基酸残基后ICl, CFTR整流特性的变化 改变 Cl- 浓度对ICl, CFTR整流特性的变化 突变为 酸性氨基酸残基后对ICl, CFTR单通道电流的影响 突变为中性 或 酸性氨基酸残基后单通道 I-V curve的变化 不同位点突变后对 ICl, CFTR 整流特性的影响 采用MTSET 或MTSES孵育细胞改变单通道 I-V curve 电极内液加入MTSET 或MTSES改变单通道 I-V curve CFTR通道的孔道结构模式图 CFTR Cl- channel 药物作用机制研究 第四部分 Molecular Structure Inhibition of CFTR Cl- currents by intracellular suramin [Cl-]o=4 mM, [Cl-]i=154 mM -- 0 mv -- 100 mV Suramin inhibition is independent of extracellular Cl- [Cl-]o=154 mM [Cl-]o=4 mM Out In + K95 + R303 NPPB Cl- Cl- Extracellular Cl- Electrical repulsion ??? Effects of intracellular suramin on CFTR single-channel currents Flickering Suramin, 6 ?M Voltage, -30 mV Suramin inhibition of CFTR channel mutants Wild K95Q R303Q Effect of channel mutnts on the affinity of suramin inhibition Mean Kd value was estaminated at -100 mV Relative roles of pore-forming positively charged amino acids on channel inhibition by intracellular glibenclamide mutant wild Relative effect of removal of positive charges in the pore on the inhibitory effects of different channel blockers Blocker K95Q R303Q Suramin 0 ++ Glibenclamide ++ + DNDS ++ + Lonidamine ++ 0 NPPB ++ 0 TLCS ++ 0 Proposed arrangement of blocker binding sites in the CFTR pore Small drug Big drug Summary 2. 分子生物学与膜片钳技术的结合是研究离子通道生物物理学特性的重