第三节 基因工程载体.ppt

10个连续的单一限制酶切位点，但它不破坏该基 因功能。 α-互补：pUC类载体带有lacz’基因，编码半乳糖苷酶氨基端片段（α-肽），此片段与宿主细胞所编码的羧基端半乳糖苷酶实现基因内互补，形成有功能的半乳糖苷酶，称α-互补。 练习题 1.列举质粒载体必须具备的基本特性。 2.某一质粒载体具有Tetr和Kanr的表型，在Kan抗性基因 内有一Bgl I的切点。现用 Bgl I切割该载体进行基因克 隆，问（1）涂皿时应加什么样的抗生素?(2)培养后长出的 菌落具有什么样的抗性基因型?(3)如何利用抗性变化筛选 到含有插入片段的重组体? 3.YAC载体具有什么样的功能性DNA序列? 4. 什么是蓝白斑筛选法? 生命科学学院 一、质粒表达载体 Ptac：IPTG诱导 GST融合蛋白—直接纯化 产物切割方便： pGEX-1?T—凝血酶 pGEX-2T---凝血酶 pGEX-3T---X因子 位相载体 融合型表达载体 (一)原核表达载体 生命科学学院 一、质粒表达载体 (一)原核表达载体 分泌型表达载体 1、主要元件： 启动子和SD序列 信号肽序列 ：SD下游，编码信号肽，可引导蛋白跨膜 2、优点：分泌表达，避免降解。 生命科学学院 一、质粒表达载体 (二)酵母表达载体 原核生物和真核生物存在翻译后修饰反应机制的差异， 真核基因在原核表达系统中难以获得有活性的蛋白。 酵母是真核表达的首选系统 酵母表达载体是一种穿梭表达载体：既能在大肠杆菌中繁殖，又能在酵母中复制、表达和选择。 生命科学学院 一、质粒表达载体 (二)酵母表达载体 DNA复制起始区（含两类复制起始序列） 选择标记（营养缺陷型或显性选择标记） 有丝分裂稳定区 表达盒(启动子、分泌信号序列、终止子等) 生命科学学院 一、质粒表达载体 (二)酵母表达载体 生命科学学院 一、质粒表达载体 (二)酵母表达载体 生命科学学院 一、质粒表达载体 (三) Ti质粒表达载体 1.天然Ti质粒的结构与及其致瘤功能 　 Ti质粒（tumor inducing plasmid)是根癌农杆菌中可引发植物产生瘤状物的质粒，是环状双链DNA。 　　　 根据诱导植物产生的冠瘿碱的不同可分为： 章鱼碱型（octopine） 　　 胭脂碱型（nopaline） 　　 农杆碱型（agropine） 　　 农杆菌素碱型（agrocinopine） [或称琥珀碱型（succinamopine）] 　其实这些Ti质粒合成不同的冠瘿碱外，在基因结构上也有一定的差异 生命科学学院 一、质粒表达载体 农杆菌与植物细胞相互作用的机制 生命科学学院 一、质粒表达载体 Ti Plasmid： 已知农杆菌附着到植物细胞后，只 留在细胞间隙中。 T-DNA首先在细菌 中被加工、剪切、 复制，然后转入植 物细胞。 生命科学学院 一、质粒表达载体 (三)Ti质粒表达载体 1.天然Ti质粒的结构与及其致瘤功能 毒性区（vir区）：激活T-DNA的转移 　T-DNA区：侵染植物时，从Ti质粒上 被切割，转移到植物细胞中，带有与肿 瘤形成有关的基因 　接合转移区（Con区）：存在与细菌间 进行接合有关的基因 　复制起始区（Ori区）： 保证Ti质粒进 行自我复制 生命科学学院 一、质粒表达载体 (三) Ti质粒表达载体 2. Ti质粒表达载体 利用T-DNA可携带DNA片段并整合到植物基因组的特性，对天然Ti质粒进行改造，用于植物转基因载体。 一元表达载体 双元表达载体 生命科学学院 一、质粒表达载体 (三) Ti质粒表达载体 2. Ti质粒表达载体 一元表达载体【也称为共整合载体（cointegrate vectors）系统】 需要同源重组才能插入外源基因。 　　pGV3850是一种受体质粒，外源基因不能直接插入，而是需要借助于pBR322质粒作为中间载体。 生命科学学院 一、质粒表达载体 (三) Ti质粒表达载体 2. Ti质粒表达载体 一元表达载体 外源基因插入pGV3850的过程 生命科学学院 一、质粒表达载体 生命科学学院 一、质粒表达载体 (三)Ti质粒表达载体 2. Ti质粒表达载体 双元表达载体：由两个分别含有 T-DNA和Vi