第六章 核酸的研究技术.ppt

第六章 核酸的研究技术 第一节 核酸分子杂交（nucleic acid hybridization） 指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。 不同来源的DNA或RNA单链在一定条件下重新组成的新的双链分子——杂交分子。 DNA的变性(denaturation)： 在某些理化因素作用下，DNA分子内碱基对之间的氢键断裂，使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过程。 解链温度（融解温度，Tm）(melting temperature)： 使50%的DNA发生变性时的环境温度。 DNA的变性从开始解链到完全解链是在一个相当窄的温度内完成的。 DNA的复性（renaturation)： 在适当条件下，变性DNA的两条互补链可再恢复成天然的双螺旋结构的过程。 2. 影响复性的因素 ① 序列简单的分子复性快，如poly(dT)和poly(dA)识别快 ② DNA片段愈大，扩散速度愈低，复性慢 ③ 离子强度↑→有利于复性 ④ DNA浓度↑→复性↑ 核酸杂交：不同来源的两条核酸单链由于具有互补序列，在一起复性时，互补序列配对，形成杂化分子。 二、影响杂交的因素 1. 核酸分子的浓度和长度 注意： ①待测核酸顺序与探针顺序同源性高的杂交，用水溶液时取68℃，用50%甲酰胺溶液时取40℃。 三、核酸探针 （一）探针的选择原则 1. 基因组DNA探针 从基因组DNA文库中选取某一基因片段 2. cDNA探针（complementary DNA） 3. RNA探针：检测DNA和mRNA 优点：杂交效率高，稳定性高，非特异性 杂交较少,未杂交探针可用RNase 降解，减少本底的干扰。 （三）探针设计原则： ①长度：10~50bp （四）探针标记物的选择 理想的标记物： 常用的放射性标记物 常用探记探针的同位素： 32P、3H、35S、14C、125I、131I 3. 探针标记的方法 ①缺口平移法（nick translation） 实质：用[α-32P]dNTP取代原来DNA链中不带同位素的同种核苷酸，生成的两条链均被同位素标记。 ③用T4多核苷酸激酶标记DNA5ˊ末端 5ˊ-pCpGpApCpG-3ˊ ④Klenow片段快速标记DNA探针末端 用枯草杆菌蛋白酶切割可得两条多肽链 常用的非放射性标记 优点：无环境污染，可较长时间贮存 四、 核酸分子杂交技术 （一）类型：根据反应环境分为 4.原位杂交（in situ hybridization） 直接用探针与细胞或组织切片中的核酸杂交。 应用：1）观察基因在组织中的表达 2）确定基因在染色体中的定位 （四）核酸杂交的应用 在医学研究与实践中，核酸杂交主要用于基因诊断。 1、遗传病的诊断：例：β-地中海性贫血 的检验 2、病原体的鉴定：例：结合杆菌的快速鉴定 3、癌基因点突变分析 4、用于骨髓移植与器官移植时的组织配型及亲子鉴定 附：蛋白免疫杂交 （一）蛋白质的免疫印迹（western) 场所：硝酸纤维素膜 待检分子：蛋白 探针：抗体 杂交的方式：经电泳分离不同的蛋白，转印到硝酸纤维素膜上，用特定的抗体与蛋白杂交，检测特定的蛋白。 （二）所用抗体 1、一抗：针对待测分子的抗体 2、二抗：针对一抗的抗体，标记有放射性同位素或生物素 （三）操作过程 第二节 核酸的测序技术 一、Sanger双脱氧终止法 (chain-terminator method) 原 理 在模板指导下，聚合酶不断将dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP）,由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取DNA的核苷酸序列。 1.双脱氧终止法测序反应体系包括： DNA聚合酶 单链DNA模板 带有3-OH末端的单链寡核苷酸引物 Mg2+ 4种dNTP(aATP,dGTP,dCTP和dTTP) 4种ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP) 2.Sanger法DNA测序的试剂 ① 引物：通常由20-23个碱基构成，G+C=12，A+T=8到11，Tm=60-68℃，避免形成引物二聚体或形成发卡样结构 ② 模板 ③ DNA聚合酶 ④ 2′，3 ′-双脱氧核苷三磷酸