半滑舌鳎LGR8基因克隆和CSW3基因的功能验证.pdfVIP

万方数据 半滑舌鳎LGR8 基因克隆和CSW3 基因的功能验证 半滑舌鳎LGR8 基因克隆和CSW3 基因的功能验证 摘 要 LGR8 是胰岛素样因子3(INSL-3)在体内的特异性受体，属于G 蛋白偶联受体(GPCR) 大家族。哺乳动物中LGR8 高表达于睾丸引带等组织；在人类研究中发现编码LGR8 和 INSL-3 的两个基因分别控制着哺乳动物雄性器官下降所必需的腹股沟韧带和索状引带的 分化发育。目前一般认为，LGR8 或INSL-3 的突变有可能导致隐睾症的发生。本实验在对 半滑舌鳎全基因组测序与转录组测序的基础上，通过RACE 的方法克隆得到了半滑舌鳎 (Cynoglossus semilaevis) LGR8 基因全长，该基因全长为2768bp,共编码734 个氨基酸。对 其进行实时荧光定量PCR 结果显示，在成熟性腺中，LGR8 在雄性中主要在脑、性腺中表 达；在雌鱼体内各组织中表达无显著差异，且雄鱼性腺和脑中的表达量要显著高于雌鱼； 通过对不同时期的性腺进行实时荧光定量PCR 结果显示，LGR8 基因在鱼体发育80 天左 右表达量开始上升，150d~210d 表达量达到最大，这表明LGR8 在半滑舌鳎性别决定和性 腺发育中起到一定的作用。 CSW3 是本实验室在对半滑舌鳎基因组测序与转录组测序的基础上克隆得到的半滑舌 鳎特有且在雌性性腺中高表达的基因，我们通过RACE 技术克隆得到了半滑舌鳎CSW3 基 因cDNA 全长。CSW3 cDNA 基因全长为1714bp，其中5 端非翻译区长173bp，3 端非翻译 区长929bp，编码区为612bp，编码共204 个氨基酸。通过定量PCR 实验结果表明，CSW3 基因为组织广谱性表达，且在卵巢中表达最高。实验通过分析CSW3 重组蛋白注射性腺后 Dmrt1 、Sox9 、Amh 、P450 等性别决定相关基因的表达调控，探讨 CSW3 在半滑舌鳎性别 决定与分化中的作用。重组蛋白注射半滑舌鳎性腺后实时定量PCR 分析结果显示，Dmrt1 、 Sox9 、Amh 、P450 等基因的表达量有不同程度的上调和下调，证明了CSW3 蛋白具有一定 的活性，可能一定程度上在性别决定中发挥重要作用。 关键词：半滑舌鳎，CSW3，蛋白注射，LGR8 基因 III 万方数据 半滑舌鳎LGR8 基因克隆和CSW3 基因的功能验证 Molecular Cloning and Expression Analysis of LGR8 and CSW3 Function Verification in the Half-smooth Tongue-sole, Cynoglossus semilaevis ABSTRACT This experiment in half smooth tongue sole on the basis of the sequencing of entire genome and transcriptome, we cloned LGR8 gene using the RACE method. The full-length of LGR8 is 2768bp, which encoding 734 amino acids. The fluorescence quantitative PCR results showed LGR8 mainly expressed in male fish in brains and testises ,and there is no significant difference among the different tissues of females. Moreov