生化分离工程实验2011.ppt

管号 1 2 3 4 5 6 7 标准蛋白质（ml） 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 蒸馏水（ml） 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 考马斯亮蓝G-250试剂（ml） 5 5 5 5 5 5 5 A595 每加完一管立即在漩涡振荡器上混合，2~5 min后以1号为对照调零测A595以标准蛋白质量（ug）为横坐标，用吸光度A595为纵坐标作标曲 注;震荡过程中不要太剧烈，以免产生较多气泡而无法消除 管号 1 2 3 4 5 6 7 HAZ和Fabz(ml） 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 蒸馏水（ml） 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 考马斯亮蓝G-250试剂（ml） 5 5 5 5 5 5 5 HAZ A595 Fabz A595 五，未知蛋白浓度的测定 将保存的纯化的蛋白各取50 ul，加50 ul蒸馏水后再加入5 ml考马斯亮蓝G-250染液试剂，漩涡震荡后静止2~5 min，以0.1 ml水加 5.0 ml的G-250试剂调零，测其在595nm处的吸光度。 生化分离工程实验（星期六） 六， 配制SDS试剂 分离胶（12%) 浓缩胶(5%) ddH2O 9.0 ml 5.0 ml 40%丙烯酰胺 6 ml 1.0 ml 分离胶-buffer 5.0 ml 不加 浓缩胶-buffer 不加 2 ml 10%APS 100 μl 60 μl TEMED 20 μl 20 μl 总体积 20 ml 8 ml 每组配两块，均采用15孔梳子 注：在配胶前注意梳子厚度（1.0mm和1.5mm）与胶板厚度的一致性 生化分离工程实验（星期天） 跑SDS点样：所有的样品和蛋白Marker点样前都要沸水浴5分钟使蛋白质完全变性。一般的点样量为10-20 ul。(记录点样顺序) 点样完毕后即可开始电泳，先以80伏电压跑15-20分钟，蛋白质通过积层胶后，更换到120伏，待溴酚蓝接近分离胶底部后停止电泳，取下胶板，小心撬开胶板割取分离胶，放入染色皿中，加入一定染色液（没过胶面即可）。置于摇床上染色3小时左右。 染色完毕后，回收染色液，加入脱色液，摇床脱色数次，最后一次可以过夜脱色。 SDS的原理 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE) 阴离子表面活性剂十二烷基磺酸钠SDS 打断蛋白质的氢键和疏水键，包裹蛋白 根据蛋白所带电荷差异和分子大小不同来分离 掩盖电荷差异和形状区别，而只与分子量有关 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳 引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N’、N’－四甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生氧自由基，激活单体形成自由基，发生聚合。化学聚合形成的凝胶孔径较小，且重复性好，用来制备分离胶； 不连续系统：缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度均不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳 本实验采用垂直板状不连续系统。所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。 浓缩效应和分子筛效应 * 左图所示的就是组氨酸，组氨酸是具有杂环的氨基酸，具有一个咪唑基团。组氨酸标签是原核表达载体上6个组氨酸的区段,在刚刚提到pET28a载体上就具有这个标签，这个标签在PH8.0时不带电,且无免疫原性,对蛋白质的分泌,折叠,功能基本上无影响.能高度亲和镍离子,用于蛋白质的亲和纯化。 右图所示的是Ni2+等过渡金属离子与次氮基三乙酸 （Nitrilotriacetic acid，NTA）形成螯合金属盐，这种螯合的金属盐可以固定在固定相粒子表面，用做亲和吸附蛋白质的配基。 * 这幅图基本表示了组氨酸标签与Ni-NTA的亲和作用的机理，从图中可以看出螯合的金属盐可以固定在固定相粒子表面，用做亲和吸附蛋白质的配基。带有组氨酸标签蛋白因此有了咪唑基团，咪唑基团的化学结构带有很多额外电子，对于带正电的化学物质有静电引力，在亲和层析中，利用这个原理进行吸附，亲和配体（也就是填料）上的阳离子（一般是镍离子）带正电对组氨酸有亲和作用。 * 我们看一下带组氨酸标签的蛋白与Ni-NTA的亲和纯化的步骤 重组质粒首先在细胞内表达，得到了带有组氨酸标签的目的蛋白。 一般情况下在细胞进行破碎之后，在上清中的蛋白质是具有天然构象未变性的融合蛋白，而在沉淀中存在的就是我们经