生化实验凯氏定氮法.ppt

实验06 植物组织中总氮含量的测定 （微量凯氏定氮法） 材料：面粉仪器设备：消化管、分析天平、微量凯氏定氮蒸馏装置、容量瓶、三角瓶、滴定管、移液管、消煮炉等。试剂： 1. 浓硫酸（AR级）；2. 30%（W/V）NaOH； 3. 30%H2O2； 4. 0.01mol/L HCl标准溶液； 5. 2%硼酸溶液； 6. 混合催化剂； 7. 混合指示剂； 8. 标准(NH4)2SO4溶液 凯氏定氮蒸馏装置 三、实验步骤 3. 蒸馏（1）仪器洗涤 冲洗完毕，从加样漏斗向蒸馏反应管加入无氨蒸馏水，清洗蒸馏反应管→打开汽水分离器阀、夹紧蒸汽发生器与蒸馏反应管之间的橡皮管，由于冷却减压使得反应瓶中废液被虹吸进入隔热套中→打开隔热套下端的活塞阀排出废液。如此清洗2-3次。 可将冷凝管下口浸入硼酸-指示剂混合液中检测清洗效果，当硼酸-指示剂混合液不变色时，表明蒸馏装置清洗干净 。 3. 蒸馏 （2）样品蒸馏 在三角瓶中装入20mL硼酸-指示剂混合液（此时应为紫红色，如变为蓝色，应倒出重装或清洗三角瓶）承接在冷凝管下端出口，将出口浸入在溶液中→打开隔热套下端的活塞→准确吸取10mL样品消化液通过加样漏斗加入蒸馏反应管中→通过漏斗加入10mL NaOH溶液→用少量无氨蒸馏水重复冲洗漏斗3次→塞紧漏斗塞，再在漏斗中加入少量蒸馏水密封漏斗→关闭隔热套下端活塞和汽水分离阀，打开蒸汽发生器与蒸馏反应管之间的橡皮管夹，开始蒸馏→观察硼酸-指示剂混合液颜色变化，从颜色变绿起再蒸馏3-5min后，将三角瓶液面移离冷凝管下口约1cm → 继续蒸馏1min左右，结束蒸馏。 3. 蒸馏 （3）空白蒸馏 用未加植物样品的消化液（其余试剂都加入并按同样方法进行消化）为空白液，按样品消化液的蒸馏方法进行蒸馏。4. 样品及空白滴定 样品和空白蒸馏完毕后，分别用0.01 mol/L盐酸标准溶液滴定，直到硼酸-指示剂混合液变回淡紫红色即为滴定终点，记录滴定样品和空白蒸馏液的盐酸用量。 （滴定空白蒸馏液的盐酸用量一般为0.2mL） 注意事项： 为了熟悉蒸馏和滴定的操作技术和检验实验的准确性及误差，常用已知浓度的标准硫酸铵溶液测试3次； 每次蒸馏前均需清洗蒸馏反应管； 在蒸馏过程中，不能同时关闭汽水分离阀和蒸汽发生器与蒸馏反应管之间的橡皮管夹； 定氮仪各连接处不能漏气。 实验07 抗坏血酸（Vc）含量的测定 （滴定法） 材料：苞菜或其他果蔬仪器设备：蒸发皿、天平、容量瓶、研钵、碱式滴定管、漏斗、移液管等试剂： 1. 2%草酸；2. 碱性2,6-二氯酚靛酚溶液（蓝色）； 3. 0.1mg/mL 标准Vc溶液（用草酸配制） 三、实验步骤 三、实验步骤 * * Designed by XK Wang 氮素代谢在植物新陈代谢中占有主导地位。测定氮素含量对于研究植物的氮素吸收、运输和代谢规律，以及确定农产品品质、营养价值等均具有一定意义。 动植物组织中的氮包括蛋白氮和非蛋白氮两大类，主要以有机氮形式存在。由于蛋白质的含氮量相对稳定，测定出样品中总氮含量，再乘上一个系数即可得出样品中粗蛋白含量。如要准确测定蛋白质含量，则需利用三氯乙酸将样品中蛋白质沉淀出来，再分别测定蛋白氮和非蛋白氮。 组织中含氮量常用凯氏定氮法测定。 一、原理 在催化剂（如CuSO4、K2SO4、硒粉等）存在的条件下，将植物材料与浓硫酸共热，有机物氧化分解成CO2和H2O，其中的氮转变为氨，并进一步生成(NH4)2SO4，这个过程称为消化。在消化后的样品中加入过量的NaOH，经强碱碱化使之分解释放出NH3,通过蒸馏借蒸汽将NH3导入过量的硼酸溶液中生成四硼酸铵；再用标准盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复到原来的H+浓度，根据盐酸的用量即可计算出样品中总氮的含量。 一、原理 以甘氨酸为例的化学反应式： 消化：CH2NH2COOH + 3H2SO4→2CO2 + 3SO2 + 4H2O+NH3 2NH3 + H2SO4 →(NH4)2SO4 蒸馏: (NH4)2SO4 + 2NaOH →2H2O + Na2SO4 + 2NH3↑ 2NH3 + 4H3BO3 →(NH4)2B4O7 + 5H2O 滴定：(NH4)2B4O7 + 2HCl + 5H2O →2NH4Cl + 4H3BO3 二、材料、仪器设备及试剂 全自动凯氏定氮仪 1. 样品消化