甲胎蛋白基因的转录水平检测.ppt

甲胎蛋白基因转录水平的检测 组员：张晋华 刘淼 黄莉玲 焦阳 实验目的 实验方法及原理 技术路线 结果分析 应用 通过提取肝癌病人的癌细胞组织和癌旁组织，根据mRNA丰度的测定方法，从转录水平对AFP（甲胎蛋白）基因的表达进行检测 肝癌病人术中切取少量新鲜的肝癌组织及癌旁1cm的肝组织，迅速至-80℃冻存。 取材 目的 通过细胞RNA的提取技术，将定量的组织中的RNA提取出来，然后使用Northern blot技术，通过琼脂糖凝胶电泳、原位转移、放射自显影，测定AFP mRNA的丰度。 Northern blot: （诺瑟杂交）是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法。首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段 原理 细胞RNA的提取 RNA的分离纯化 4.RNA转移和固定 琼脂糖凝胶电泳分离RNA 探针分子杂交 放射自显影 TRIzol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。 TRIzol法 匀浆处理:将组织在液氮中磨碎 ,100mg组织中加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。 室温（15-30℃）放置5分钟。 加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。 2-8℃10000×g离心15分钟。 把水相转移到新管中。用0.5ml异丙醇沉淀水相中的RNA。室温放置10分钟。 6.2-8℃10000×g离心10分钟，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀，收集沉淀。 7.用70℅乙醇洗涤RNA沉淀。至少加1ml 70℅乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。 8.得到RNA。 RNA样品中不应存在对酶（如逆转录酶）有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子。避免其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染。排除DNA分子的污染。 纯化要求 1、凝胶准备：用0.5×TBE配制2％琼脂糖凝胶。 ① 称2g琼脂糖置三角瓶中，加100ml 0.5×TBE； ② 微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖； ③熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃时，加入EB 0.5μg/ml，并轻轻混匀。 2、胶床准备： ①取出洗净并晒干的胶床和梳子，在胶床未封闭 的两端贴上胶布或胶带纸，形成约5～8mm的挡墙。 ②将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端 和床面有1mm的间隙。 ③将胶床放在调整好的水平台上。 铺胶：将冷却致60℃的凝胶倒入准备好的胶床内，凝胶厚度3～5mm。 室温下静置1小时左右，凝胶固化。撕去胶床两端的胶带纸，将带凝胶的胶 床置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极。 向电泳槽中加入0.5×TBE电泳缓冲液，以越过凝胶表面1～2mm为宜。 轻轻拔出固定在凝胶中的梳子。原梳齿处 (样品孔) 即被缓冲液充满，如发现有气泡，应设法去除。 样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀。 上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中。加样量一般10～30μl。 盖上电泳槽，接通电源，开始电泳。开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。电泳条件：电压1～5v/cm；时间1小时左右。 电泳结束后，切断电源，取出凝胶。 电泳结果分析 紫外灯下观察RNA。测量从加样孔到各条带的距离。一RNA片段大小的对数值对迁移的距离作用，用得到的曲线课计算点杂交检测到的RNA大小 Northern印迹 又称RNA印渍术，是将存在于凝胶中的RNA分子转移（印渍）于固定化介质(如：硝基纤维素膜)上并加以检测分析的技术，可以用合成的寡核苷酸片段作为探针，也可以用克隆或提取的DNA片段作为探针进行标记，特点专一性好，假阳性率低，用于RNA水平分析等。 取出凝胶，水中浸泡2次，每次5min。 室温下将胶浸到50mmol/LNaOH和10mmol/LNaCl中45min，水解高分子RNA，以增强转印。 室温下将胶浸到0.1mmol/L TrisHCl(pH7.5)中45min,使胶中和。 20×SSC洗胶1h。 20×SSC中过夜转印到硝酸纤维素膜上。 取出硝酸纤维素膜，80℃真空烘烤2h。 基因探针，即核酸探针，是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。（将一段已知序列的多聚核苷酸用同位素、生物素或荧光染料等标记后制成的探针） 根据美国PE公司提供的引物探针设计软件，设计的MGB探针序列如下：5’（FAM）－TACTGCAGAGATAAGTTT－3’（TAMRA）探针是由上海基康生物工程公司合成。 ——来自网络资料参考 放射自显