奶牛早孕诊断试纸条的研制及临床试验.pdf

· 22· 中国奶牛·2oo7年第l2期 奶牛早孕诊断试纸条的研制及临床试验 万积成 ，万志静 ，唐晓宾 ，王红玲 ，廖晨星：，王跃进s，邢风轶 ，黄联华s (1．北京万华生物工程有限公司，北京 100018；2．北京三元绿荷奶牛养殖中心一分公司，北京 101105； 3．北京市沧达福奶牛公司，北京 102609；4．北京浅山牧业有限公司，北京 101500； 5．北京华晨养殖场，北京 101313) 中图分类号：$823．3+5 文献标识码：B 文章编号：1004—4264(2007)12—0022—04 摘要：用抗孕酮单克隆抗体S，B 2D 和羊抗鼠IgG分别固定于硝酸纤维膜，并与胶体金标记的抗孕酮单克隆抗 体S，B 3E G 及其它试剂，应用层析式双抗体夹心法原理研制奶牛早孕诊断试纸，在北京10家奶牛场进行临床 检测试验，对l 559头荷斯坦奶牛乳汁中孕酮含量进行临床符合验证。结果表明。该试纸条灵敏度高，最低检出 量达5～8ng／mL。与无关抗原均无交叉，且批内、批间变异小；检测1 559头奶牛，孕牛l 316头，其中试纸检测结 果阳性1 274头。可疑32头。复测阳性22头，孕牛阳性临床符合率96．8％；复测后阳性总符合率达98．5％。阴性 对照243头，其中试纸检测结果阴性236头。可疑6头。复测阴性2头。阴性临床符合率为97．1％，复测后阴性总 符合率97．9％。结论：北京万华生物工程有限公司研制的奶牛早孕诊断试纸能够快速、准确地进行奶牛早期妊娠 诊断。 关键词：奶牛；孕酮；早期妊娠；胶体金试纸条 简便而有效的奶牛早期妊娠诊断方法是养牛生产 金酸、柠檬酸三钠、NaHCO3、PBS、K2CO3、PEG20000、柠 者及畜牧兽医工作者长期以来亟待解决的问题。1958 檬酸缓冲液(以上化学试剂均为分析纯或优级纯)、孕酮 年．Short发现奶牛外周血浆中孕酮浓度的变化可以反 标准品(Sigma)、硝酸纤维素膜(美国Millipore公司)、 映母牛所处的生殖状态。后来。Laing和Heap(1971)首 吸水玻璃纤维纸(美国)、吸水板(北京昌平兴寿纸制 次利用孕酮的RIA检测法．证实了奶牛乳汁和血浆中孕 品厂)、塑料板(北京中源塑料厂)、高速低温离心机 酮的水平所反映的发情周期各阶段与直肠检查法所评 (Beckman)、磁力搅拌器(Fisher Scientitle)、紫外分光光 估的结果相一致【n 北京万华生物工程有限公司在完成 度计(日立U2000)、DZF一6020真空干燥箱(上海博迅 国家十五重大科技专项课题任务时．对孕酮免疫原合成 实业有限公司)、XYZ3000喷金喷膜机(美国)、切条机 和单克隆抗体制备有了重大发现．获得了针对孕酮小分 (Kinematic Automation)等。 子半抗原两个不同抗原决定簇的单克隆抗体，实现了 1．2 方法 对奶牛乳汁中孕酮激素含量的高灵敏度检测。在此基 1．2．1 金标抗体溶液的制备及喷金 础上，用胶体金双抗夹心法研制了奶牛早孕诊断试纸， 采用枸橼酸三钠还原法制备胶体金溶液，量取氯 进行早期妊娠诊断试验。目前国内外尚未见报道，现报 金酸溶液(简称金液)250mL，加0．2mol／L K2CO3，调pH值 道如下： 至6．5~7．0，搅拌10min；取孕酮单克隆抗体S3B 3E。G。加 1 材料与方法 入到250mL金液中搅拌30min；加入20％PEG20000， 1．1 材料 搅拌5min：再加入 10％BSA，搅拌 10min；离心弃上清 孕酮单克隆抗体S3B 3E G 和S3B 2D,A6(本公司细 液．同时在紫外分光光度计下进行分析，波长为540nm