4789.14蜡样芽胞杆菌检验.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 以无菌操作取样品25 g（mL），加入PBS 225 mL，用旋转刀片式均质器以8000 r/min～10000 r/min均质1 min～2 min，或拍击式均质器拍击2 min。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵中磨碎，然后称取25 g（mL）置合适的容器中，加225 mL PBS，充分振荡混匀。制成1:10的样品匀液。 5.3.1 增菌 取1：10的样品匀液10 mL（液体样品可以选择原液），加入90 mL胰酪胨大豆多粘菌素肉汤中，于30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h。 5.3.2 分离 取胰酪胨大豆多粘菌素增菌液划线接种于MYP琼脂平板上。于30 ℃±1 ℃培养24 h～48 h。观察平板上生长的菌落。在MYP琼脂平板上，典型菌落为灰白色至微粉红色，周围有白色至淡粉红色沉淀环。 MYP琼脂平板 5.3.3 纯培养 从每个平板选取至少5个典型或可疑菌落，划线接种于营养琼脂平板做纯培养，30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h，进行确证实验。营养琼脂平板上，典型菌落在为灰白色，偶有黄绿色，不透明，表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状，边缘常呈扩展状，直径为4 mm～10 mm； 浙 江 省 疾 病 预 防 控 制 中 心 5.4.1　样品的稀释 吸取1：10的样品匀液1 mL加到装有9 mL PBS的稀释管中，充分混匀制成1：100的样品匀液。据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。 5.4.2.1 选择2～3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度分别吸取0.1mL接种到MYP琼脂平板上，每稀释度接种两个MYP琼脂平板。用无菌L棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。使用前，如MYP琼脂平板表面有水珠，可放在25℃ ～ 50℃的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。 5.4.2.2 涂布后，将平板置于30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h后（原标准为36 ℃±1 ℃培养12 h～20 h） ，选取具有15个～150个典型或可疑蜡样芽胞杆菌菌落的平板，进行计数。并计算同一稀释度两个平板的平均菌落数。如果菌落不典型，可继续培养18 h～24 h再计数。 5.4.2.3 计数后，从每个平板选取至少5个已计数的典型或可疑菌落，如果一个平板上少于5个典型或可疑菌落，则取所有典型或可疑菌落，分别划线接种于营养琼脂平板， 30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h，进行确证实验。 5.4.2.4 根据确证实验确定为蜡样芽胞杆菌的菌落数，按比例计算出该平板上蜡样芽胞杆菌菌落数，然后计算同一稀释度两个平板的平均蜡样芽胞杆菌数，再乘其稀释倍数，再乘以10，即得每g（mL）样品中蜡样芽胞杆菌数并作出报告。 例：将检样10-4稀释液0.1 mL涂布于MYP琼脂平板上，一块平板形成的可疑菌落数为65个，另一块平板形成的可疑菌落数为56个，各取5个进行鉴定，证实第一块平板蜡样芽胞杆菌的是4个，第二块平板蜡样芽胞杆菌的是5个，则1 g（mL）样品中蜡样芽胞杆菌数[cfu/g(mL)]为[(65×4/5) +(56×5/5)]÷2×104×10＝5.4×106。 适用于蜡样芽胞杆菌污染数小于103 cfu/g(mL)的食品。 5.4.3.1 取10-1、10-2、10-3三个稀释度的样品匀液，接种于10 mL胰酪胨大豆多粘菌素肉汤中，每一稀释度接种3管，每管接种1 mL（如果接种量需要超过1 mL，则用双料胰酪胨大豆多粘菌素肉汤）。于30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h。 5.4.3.2 用直径3mm左右的接种环，从各管中移取1环，划线接种到MYP琼脂平板上，30 ℃±1 ℃培养24 h～48 h。 5.4.3.3 从每个平板选取至少5个典型或可疑菌落，划线接种于营养琼脂平板做纯培养， 30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h，进行确证实验。 6.1　形态 挑取纯培养的单个菌落，作革兰氏染色镜检。蜡样芽胞杆菌为革兰氏阳性芽胞大杆菌，大小为（1～1.3）μm×（3～5）μm，芽胞呈椭圆形位于菌体中央或偏端，不膨大于菌体，菌体两端较平整，多呈短链或长链状排列。 挑取纯培养的单个菌落，进行酪蛋白分解试验、动力试验、V-P试验、硝酸盐还原试验、糖发酵试验、溶菌酶耐性试验，蜡样芽胞杆菌的主要生化特征见表1。 挑取单个可疑菌落划线接种于营养琼脂平板上，30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h。蕈状芽胞杆菌形成根状生长的特征。多数蜡样芽胞杆菌菌株形成粗糙的似毛玻璃状或融蜡状的菌落。 挑取纯培养的单个可疑菌落接种于TSSB琼脂平板上，30 ℃±1 ℃培养