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蛋白质印迹 （western blot); 蛋白质印迹（western blot)的定义; 聚丙烯酰胺电泳分离蛋白质具有很好的分辨率和实用性， 但要对各种蛋白质作进一步分析(如表达信号的强弱)就受 到限制，因为电泳后大部分蛋白 质分子被嵌在凝胶介质 中，探针很难通过凝胶到 达目标蛋白，且探测过程中的 扩散现象会破坏邻 近蛋白条带的特征。 ;为解决这些技术问题，人们将电泳后凝胶中的蛋白质转 移到一种化学惰性的高分子支持物——固相转移膜上， 使蛋白质分子更容易与探针结合，且机会均等；将蛋白 质富集浓缩在固相转移膜上，以减少扩散，提高了分析 的灵敏度，并能在转移膜上进行多种分析。 ;蛋白质印迹技术原理：;步骤：; (3)免疫结合反应：用目的缀白的抗体与转移膜上的目 的蛋白(靶蛋白)进行特异性免疫结合反应，再用标记过随 二抗与膜上的一抗反应。 (4)检测：根据连接二抗标识物的检出，如：化学发光、 显色和放射性同位素测定等，检测出目的蛋白的存在。 ;; 蛋白质免疫印迹技术检测肺癌组织上皮钙粘蛋白的表达：;结果:癌组织、癌旁组织、远癌组织E-cad的阳性率分别 为36．7％、70．O％、96．7％。癌组织E—cad阳性率 明显低于癌旁组织(P0．017)，也明显低于远癌(P0．0 17)；癌旁组织E．cad阳性率明显低于远癌组织(P0．0 17)结论E—cad蛋白表达减少或缺失与肺癌有相关性，与 肺癌的组织类型无相关性。 ; 肺癌是当前常见的恶性肿瘤之一。根据全球2002年癌症 统计资料，无论从发病数135万／年和死亡数118万／年 来看，肺癌都排在所有恶性肿瘤之首‘川。目前，有学者 认为细胞粘附分子的重要成员之一——上皮钙粘蛋白(E —cadherin，E．cad)的表达减少或功能异常是导致肿瘤 发生、发展的重要原因之一。;;（一） 材料;离肿瘤边缘1—2 cm的癌旁组织和距离肿瘤边缘6 cm以上 的远癌组织，分装于不同的冷冻管中，放液氮中保存。5 例对照为3例肺结核患者，2例肺错构瘤患者，组织取自病 灶以外的肺组织。 2．试剂和实验材料 Bio．Rad蛋白测定试剂盒和蛋白 印迹用的免疫印迹一多聚亚乙烯基氟化物膜(immun—blo t PVDF membrame)。Western blot电化学发光底物。小 鼠抗人E—cad单克隆抗体。; 小鼠抗人3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体。辣 根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。两步法通用型检测试剂 SupervisionC D一3004和3—3-2氨基联苯胺(DAB)显色 剂。 ;（二） 方法;鼠抗人E—cad单克隆抗体，摇床上振摇1 h或过夜，用含 吐温20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤3次，每次10 min。 再加入1：400稀释的羊抗鼠IgG-HRP，摇床上振摇1h， PBST洗涤3次，每次10 min。电化学发光(ECL)试剂显 色、曝光，并用扫描仪进行扫描。 2．免疫组化 操作流程为：石蜡切片常规脱蜡水化， 3％过氧化氢(H2O2)60 min灭活内源性过氧化物酶，磷 酸盐缓冲液(PBS)洗3次，每次5 min，高压修复1．5 min;PBS冲洗3次，每次5 min，50％山羊血清抗原封闭，37 ℃下孵育60 min，滴加一抗4℃孵育过夜，PBS冲洗3次， 每次5 min，滴家二抗室温孵育60 min，PBS冲洗3次， 每次5 min，链霉亲和素一过氧化物酶室温孵育60 min， PBS冲洗3次，每次5 min，DAB显色，苏木素复染后常 规脱水，透明，封片。阳性对照由福州迈新技术有限公司 提供的阳性切片，用PBS替代一抗做阴性对照。 ;结果判断：; 根据(1)(2)两者的乘积判断阳性等级。0分为阴性，1～4 分为弱阳性(+)，5—8分为阳性(++)，9～12分为强阳性 (+++)。(+)以上者视为阳性。 ;统计学方法;结果：; 癌组织、癌旁组织及远癌组织E-cad的阳性率见表l。经 卡方检验分析．E．cad的阳性率在癌组织、癌旁组织以 及远癌组织中的表达差异具有统计学意义(卡方等于24． 83，P0．05)。进一步进行两两比较的，E-cad在癌组 织分别与癌旁组织和远癌组织之间的表达差异有统计学 意义(卡方等于6．70，P0．017济2=24．3，P0．017 )；E-cad在癌旁组织与远癌组织之间的表达差异亦有统 计学意义(卡方等于7．68，P0．017)。 ;;;; 二、免疫组化结果; 5例患者的远癌组织E．cad均呈阳性表达，阳性部位主 要在胞膜表达，呈现出深黄至棕黄色颗粒，清晰，见图4， 提示细胞之间有功能良好的细胞间隙连接和细胞粘附存 在