1构建质粒.docx

基因序列分析：同源比对（保守性）不同蛋白比对相似序列预测结构域记录：保存预测结果（同源性、二级结构）记下mapping片段（mapping时以亲水端开头，考虑溶解性），相关性质（分子量、等电点、碱性残基数（R250）、W+Y数目、摩尔吸光系数）确定载体（原核：His-tag/Trx-tag/MBP-tag；真核：GFP-tag/Cherry-tag/Flag-tag）网站：NCBI CDS（mRNA编码区)Expasy软件：Jalviewsequence alignment：a、用目的基因序列进行BLAST（NCBI），比较不同物种间（哺乳、两栖、低等……）该基因的保守性（xp,np来源较可靠）。（或直接基因名+物种名进行有哪些信誉好的足球投注网站）； Main:human/Homo sapienschimpanzee/Pan troglodytesmonkey/Macaca mulattadog/horse/Equus caballuscattle/Bos tauruspig/ Sus scrofamouse/Mus musculusRat/Rattus norvegicuschicken/ Gallus gallusfrog/ Xenopus (Silurana) tropicaliszebrafish/ Danio rerio_chimpanzee_monkey_dog_horse_cattle_pig_mouse_Rat_chicken_frog_zebrafishb、将FASTA导入记事本后，用ClustalW2进行align，（option-Input），根据结果删除差别大的、重要性小的。2）功能域预测：用SMART预测domain，（full annotation看domain相关信息）。不够准确!3）比较相似结构：用sequence进行有哪些信誉好的足球投注网站（PDB），BLAST看相似度，用pymol分析相似结构，将未算出相似结构的进一步有哪些信誉好的足球投注网站。pymol结构分析：（可选取片段保存；command：load[protein code]）Generate-symmetry mates看晶胞中堆积方式（+cap帮助堆积）复合物与单体进行align，看结合面查阅报道相似结构的文献sequence pattern：二级结构预测：Jpred、PSIPRED（截片段）三级结构预测：Phyre2（full length）引物设计：分析自身酶切位点：软件DNAMAN（copy/paste/select/load sequence/from selection/restriction analysis），选择要用的酶切位点（注意同尾酶， BgLⅡ和BamHⅠ）设计引物：软件Primer Premier（突变时不考虑酶切位点；一段引物+（终止密码子）+酶切位点+保护碱基（注意读码框），长度为15-25bp左右；上下游引物的Tm尽可能相近，不要多于4bp互补；引物在未加酶切片段前，Tm=55左右；3’端为C或G；）记下引物序列（酶切位点用小写表示）以及Tm值，订购引物突变引物：环P，平末端连接四引物环p，Dnpi酶解甲基化质粒PCR:克隆基因名称60?L体系：5x Q5 Buffer12?LdNTP(2.5mM)2.4?LP13?L（10?M）P23?LGene1??L （Nanodrop测得100，一般稀释1/10）Q5 0.6??L （与Easy Tag相比效率高，是高保真酶）ddH2O38??L （加入GC enhancer 12??L时，为26??L）分为6个10??L，执行梯度PCR程序：98℃：3min98℃：8s（多为52-64℃，记下6管对应值）：20s72℃：（1min/2Kb）(循环25-30次)72℃：10min12℃：2h琼脂糖凝胶电泳：配1%琼脂糖凝胶：称1g Agarose Gel，加入100mLTAE Buffer，微波炉中高热2min溶解，冷却2min后加入2dEB，倒入模具冷却。电泳：上样：Sample（10?L）+ 6xLoading Buffer（2?L）电泳：150-160V/10-15min（150V/7min）在UV下观察条带胶回收：切下目的DNA条带，放入EP管中，+400?LPC Buffer，金属浴60℃/10min将该溶液移至预先用500?LBL Buffer平衡的CB2柱中，结合5min，离心9000rpm/1min+300?LPC Buffer，洗去多余的胶，离心12000rpm/1min，弃去滤液2X (+600?LPW Buffer，离心12000rpm/1min，弃去滤液)离心12000rpm/3min，金属浴62℃/10min+30?L预热的ddH2O，结合6min后，离心12000rp