基因操作实验讲义.doc

硕士研究生基因操作实验讲义实验简介：本实验的目的是将1411的淀粉酶结构基因采用PCR方法扩增后接入大肠杆菌表达载体pLac18，构建成重组载体pLac18-，重组载体再转化大肠杆菌，重组大肠杆菌可以在IPTG的诱导下表达出耐热α-淀粉酶活性。实验一 质粒DNA的提取、电泳鉴定 实验材料LB培养基 ：NaCl 10 g/L, Trypton 10g/L, Yeast Extract 5 g/LLB培养基 ：NaCl 10 g/L, Trypton 10g/L, Yeast Extract 5 g/L含质粒的大肠杆菌台式高速离心机水浴锅 ③加入100 ?L溶液1，彻底悬浮菌体。 ④加入150 ?L溶液2，颠倒离心管数次，使细菌完全裂解，溶液透明。 ⑤加入150 ?l溶液3，颠倒离心管6-8次，可见白色絮状物产生，室温放置10 min，8,000 r/m离心3 min。 ⑥在离心吸附柱中加入结合缓冲液（质粒提取专用）400 ?l，再将上清液加入离心吸附柱中，混匀，8,000 r/m离心30 s。 ⑦倒弃收集管内液体，在吸附柱内加入500 ?l漂洗液，8,000 r/m离心30 s，洗去杂质。 ⑧倒弃收集管内液体，8,000 r/m离心30 s，除去残留液体。 ⑨将质粒纯化柱放在一干净的1.5 mL离心管中，加入75 ?l 洗脱缓冲液（elution buffer）至管内柱面上，放置10 min。 ⑩8,000 r/m离心30 s，所得液体就是立即可用的超纯质粒。 1.3 质粒的酶切与电泳鉴定 质粒的酶切 实验材料 质粒pLac18，上述实验提取 限制性内切酶EcoR I、Hind III：宝生物工程（大连）有限公司产品，由上海浩嘉生物技术公司赞助，包括酶20 U/?L，酶反应缓冲液等 实验步骤 取已灭菌的500??L离心管一支，用记号笔标上组号，依次加入双蒸水12??L，质粒5 ?L，缓冲液M 2 ?L，限制性内切酶1 ?L，混匀。 将上述溶液于37 ℃水浴30 min。 酶切产物的电泳 实验材料和仪器 50×TAE缓冲液：Tris 242 g，冰醋酸 57.1 mL，0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 100 mL，定容至1 L TAE缓冲液：取50×TAE缓冲液10mL，加入纯水至500 mL 溴化乙锭溶液：10 mg，加水至1 mL，充分溶解 琼脂糖：华美公司分装Amresco产品 电泳槽：迷你-31B型，北京六一仪器厂（含电泳槽，制胶槽） 电泳仪：DYY-6B 稳压稳流电泳仪 凝胶成像仪：美国alpha2200 取50 mL小烧杯一个，加入琼脂糖0.14 g，加入TAE缓冲液20 mL，在电炉上煮沸。 放置到约50 ℃时，加入溴化乙锭溶液1 ?L，混匀，倒入制胶槽中，插上制胶梳子。 待凝胶凝固后，将凝胶放入电泳槽内，拔取制胶梳子。 取待检测DNA 4 ?L，加入0.5 ?L加样缓冲液，混匀。 将加入了加样缓冲液的待测样品加入加样孔中。 打开电泳仪，调节电压至50 V，保持稳压。 电泳约50min～，关闭电泳仪，小心取出凝胶，将凝胶放入凝胶成像仪中，观察电泳结果。 实验二 嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶基因的PCR扩增PCR产物的纯化1．取00 μL PCR管一支按顺序加入： μL 引物: 2 μL 嗜热脂肪芽孢杆菌染色体DNA 1 μL 94℃变性10 min, 加入Taq DNA聚合酶个单位2．混合后进行PCR反应 (94℃ 60 s，58℃ 60 s，72℃ 120 s)，经过0个循环后 在72℃延伸10 min。 ?L），转移到一干净的1.5 mL离心管中，加入5倍体积的Binding Buffer（PB），混匀。 2. 将硅胶柱放入收集管中，把混合液转移到柱内，室温放置2分钟；8,000 r/m离心30 s。 3. 倒掉收集管中的废液，将硅胶柱放入同一根收集管中，加入500 ?L 漂洗液（Wash Solution），8,000 r/m离心30 s。 4. 重复步骤4。 5. 倒掉收集管中的废液，将硅胶柱放入同一根收集管中，8,000 r/m离心30 s。 6. 将硅胶柱放入一干净的1.5 mL离心管中，在硅胶柱的膜中央加入50 ?L TE Buffer，室温10 min。 7. 8,000 r/m离心30 s，离心管中的液体即为回收的DNA片段。 C. PCR产物的酶切鉴定 取已灭菌的500??L离心管一支，用记号笔标上组号，依次加入双蒸水12??L，质粒5 ?L，缓冲液K 2 ?L，限制性内切酶BamH I 1 ?L，混匀。 将上述溶液于37 ℃水浴60 min，50V电泳60 min电泳鉴定酶切结果。 实验三 感受