1-生态环境学报.DOC

深海热液喷口周围微氧耐压细菌的培养研究 黄菊芳1，曾乐平1，周洪波2, *，童建斌1 1. 中南大学基础医学院，湖南 长沙410083；2.410083 摘要：研究采用析因实验设计，探讨了培养基的水源、培养温度和生长pH等因素对喷口细菌生长繁殖的影响，初步探索了常压下东太平洋某海底喷口周围微氧耐压细菌的生长条件。样品培养10 d后，对培养液中细菌量进行显微计数，实验数据用SPSS11.0统计软件中的方差分析程序进行处理。统计结果显示：在标准大气压下，从研究样品中获得最多细菌数的较优培养条件为：培养基水源为单蒸水；生长pH为7.60；培养温度为50 ℃。在该条件的培养液中细菌平均浓度达2.596×106个/mQ93-335; Q178.533 文献标识码：A 文章编号：1672-2175（2005）06-0894-04深海热液喷口周围的微生物资源因其在生命起源的研究、新药品和新资源的开发、人类生存环境和社会的可持续发展等方面具有巨大的潜在价值而引起了广泛关注。目前，研究深海生物圈生物的研究方法主要有原位研究[1]、分离培养[2]和分子生态学研究方法[3]三种。原位研究在研究深海微生物的生长代谢状况上取得了一定进展，但原位研究不能观察微生物生长的动态过程。尽管分子生态学研究极大的丰富了海底热液喷口微生物种类的知识，却无法达到开发利用的水平。分离培养研究方法可以较好的解决上述两种方法的弊端，达到进一步认识和开发利用该生境中的微生物资源的目的。与陆地微生物相比，深海微生物均是嗜压或耐压微生物[4]。由于物种自身特性或实验技术的原因，目前从该生境中获得分离培养的微生物的数量甚少[5(7]。国外在该研究领域中已经开展了大量的工作，而国内才刚刚起步。针对上述情况，在常压下对深海热液喷口微氧耐压细菌进行了初步的富集培养探索，为纯培养及进一步研究打下基础。 1 材料和方法 1.1 材料 东太平洋某喷口泥沙样品由中国国家海洋局第二研究提供。取10 g样品，在无菌条件下加100 mL无菌人工海水并在磁力搅拌器上充分搅拌，浑浊液即作为菌样。 1.2 培养基的成分与制备 人工海水基本盐[5, 8, 9] (g/L)：NaCl：24.4770Na2SO4：3.9170KCl：0.6640MgCl2·6H2O：4.9810CaCl2·H2O：1.1020NaHCO3：0.1920KH2PO4：0.1500MnCl2·4H2O：0.2000FeSO4·7H2O：2.0000； Na2S2O4：1.0000：KBr：0.0960SrCl2·6H2O：0.0050NaF：0.0039H3BO3：0.0260NiCl·6H2O：0.0150ZnCl2：0.0500；BaCl2：0.0050CuSO4·5H2O：0.0100MnSO4·H2O：0.1500CoCl2·6H2O：0.0050(NH4)6MoO4·2H2O：0.1000KI：0.05005.0000；酵母浸出物：0.20000.25 μm的无菌微孔滤膜过滤除去溶液中直径大于250 μm的颗粒（以防镜检时产生干扰）；然后分为两部分，一部分直接高压蒸汽灭菌备用；一部分先煮沸去氧冷却后加入微量盐和有机物，然后用孔径为0.22 μm的无菌微孔滤膜过滤除菌，最后两者混合即为培养基。 1.3 培养条件设置 按照Stanley等人[10]的海底热液喷口周围pH接近于中性变化而温度变化以10～20 ℃33 ℃、50 ℃、65 ℃pH设为：6.00、7.60、8.501.4 实验设计 实验采用析因设计见图1。图中A、B和C的每一种组合作为一个实验点，每个实验点做实验样和对照样各3个。培养器皿为250 mL的灭菌锥型瓶。每个锥型瓶中加150.00 mL灭菌培养基。实验样接种500 μL菌样；对照样接种500 μL灭菌培养基。每天定时补充无菌去离子水以维持培养液体积的恒定。所有操作均在无菌操作台上进行。 1.5 细胞计数 持续培养10 g后，在无菌条件下取培养液1 mL 直接置于无菌1.5 mL的EP管中1000 r/min离心3 min，上清液用血球计数板做显微镜直接计数[11]。 1.6 统计学方法 析因实验设计及其方差分析是将两个或多个处理因素的各个水平进行排列组合，交叉分组进行实验，用于分析各因素之间的交互作用，通过比较各因素不同水平的平均效应和因素间的不同水平组合下的平均效应，也通过比较不同变异来源的均方，借助F分布做出统计推断，得出各种研究因素对实验结果有无影响，并寻找最佳组合[12]。利用SPSS11.0统计软件对数据进行处理[12]。 2 结果与分析 表1给出3个实验因素及其各水平组的样本量。 表2（下页）数据显示：3个实验因素对富集培养菌量的影响十分复杂，不仅存