2014-02-20承担单位：福建省农科院农业生物资源研究所试验设计.DOC

2014-02-20 承担单位：福建省农科院农业生物资源研究所 试验设计： 试验项目：Far-WB分析Cry2Ab蛋白和原核表达APN的相互作用 试验人员：许炼 试验负责：朱育菁、潘志针 报告日期：2014-02-20 计数月份：2014年月 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设计，实施实验，记载，分析清晰，结论清晰文献完整，发表水平 福建省农业科学院农业生物资源研究所 农业微生物研究中心 电话: 0591 传真: 0591试验目的 苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是目前应用最广泛的微生物杀虫剂，其特征之一是孢子形成的过程中同时产生伴孢晶体（主要成分是有杀虫效应的δ-内毒素），其中的Cry蛋白是杀虫机理研究最透彻、应用最广的δ-内毒素之一[1,2]。 目前Bt毒素的杀虫机理尚不明确，己被普遍接受的苏云金芽抱杆菌作用机制认为:Bt所产生的C巧毒素蛋白晶体被昆虫取食后，昆虫肠道中的碱性蛋白酶[]将其特异性的水解，使得毒素前体活化为具有杀虫活性的毒素。活化后的毒素能够特异的与昆虫中肠BBMV上的受体蛋白相互结合，然后这种毒素与蛋白的结合体形成空洞使肠道破损[]，这些空洞结构能够让水分子和离子自由穿过，破坏了细胞的通透性，和肠道细胞的内环境，最终导致昆虫的死亡[]。 APN、类钙粘蛋白、ALP、糖脂、肌动蛋白等被推测可能是Bt在小菜蛾BBMV上的受体，但究竟哪种是毒蛋白的主要受体，与毒素结合后对小菜蛾产生致死效应尚未明确[]。本研究采用分析试验方法 Cry2Ab蛋白(200μg/mL)。 APS(电泳级)、TEMED（电泳级）购自泰京生物技术有限公司；丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺上海佑隆生物科技有限公司BeyoECL Plus(超敏ECL化学发光试剂盒)Millipore公司；定影粉、显影粉购自上海自升达有限公司。 2.1.3 仪器 PowerPac垂直电泳仪、电转仪（BIORAD），Centrifuge 5418R（Eppendorf），暗室灯，显影器。1×电转液 Tris-base 3g Glycine 14.4g 甲醇 200mL 去离子水定容至1L，常温保存。 1×TBST Tris-base 3g NaCL 8g 加800mL去离子水，浓盐酸调节PH至7.4，去离子水定容到1L，-4℃保存，用时加μL的吐温20，现配现用。 封闭液 脱脂奶粉0.5g，1×TBST定容至20mL，现配现用。.1 APN蛋白的诱导表达 晚上将含有pET30-a(+)-重组质粒的BL21菌液10μL接种到10mL LB-KANA液体培养基，1rpm、℃过夜。第二天吸取菌液，重新接种到mL LB-KANA液体培养基，220rpm、37℃培养3h，此时菌液的OD值约在0.6-1.0之间分成两，LB-KANA液体培养基℃诱导。菌液000rpm离心3min，菌体加μl 2×loading buffer和μl的去离子水，混匀后煮沸10分钟。1000rpm离心10min，收取含有蛋白的上清，分装成20μl后-80℃存储。2.3.2 SDS电泳 SDS选用10%的分离胶浓缩胶和分离胶的配方如下： 胶 去离子水 1.9mL 30%Acr-Bis 1.7mL 1.5mol/L Tris-Hcl，PH 8.8 1.3mL 10%SDS 50μL 10%AP 50μL TEMED 3μL Total 5mL 浓缩胶 去离子水 1.4mL 30%Acr-Bis 0.33mL 1.5mol/L Tris-Hcl，PH .8 0.25mL 10%SDS 20μL 10%AP