5感受态细胞制备和转化.PPT

感受态细胞制备Preparation of competent cell 实验原理 受体细胞经过一些特殊方法(如电击法、CaCl2、RbCl等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞）。 实验材料和试剂 实验材料：E. coli DH5α菌(R-，M-，Amp-)。 实验试剂： LB液体培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于800ml去离子水中，用 NaOH 调pH至7.5，加去离子水至总体积1L，高压下蒸气灭菌20min。 LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉，高压灭菌。 0.05mol/L CaCl2溶液：称取0.28g CaCl2(无水,分析纯)，溶于50mL重蒸水中，定容至100mL，高压灭菌。 实验仪器 实验步骤 菌体的培养 受体菌的培养从 LB 平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落，接种于3-5mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养 12h 左右，直至对数生长后期。 再将该菌悬液以 1: 100-1: 50 的比例接种于100mL LB液体培养基中，37℃振荡培养 2-3h 至OD600为0.5左右。 将培养液转入离心管中，冰上放置10min，然后于4℃下3000g离心10min。 弃去上清，用预冷的 0.05 mol/L 的CaCl2 溶液10mL轻轻悬浮细胞，冰上放置 15-30 min 后，4℃ 下 3000g 离心10 min。 弃去上清，加入 4mL预冷含15%甘油的 0.05mol/L的CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。 感受态细胞分装成 200μL的小份，贮存于-70℃可保存半年。 实验注意事项 细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从-80℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5×107 个/mL左右，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。 实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造成菌体破裂，影响转化。 * 实验五 台式高速冷冻离心机 恒温摇床 制冰机 2. 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法) *