MF205-M5 6xHis Ni-Agarose Resin His琼脂糖凝胶.DOC

M5 6xHis Ni-Agarose Resin His琼脂糖凝胶使用说明书 产品名称 单位 货号 M5 6xHis Ni-Agarose Resin 10ml MF205-01 【STORAGE】 Store at 4°C. Stable for one year from the date of shipment. 【产品简介】 本产品对6×His-tag蛋白具有显著特异吸附能力，能够高效一步纯化带有6个组氨酸亲和标签的蛋白。该产品具有4个Ni2+螯合位点，较只有3个螯合位点的Ni-IDA结合Ni2+更为牢固，有效防止纯化过程中Ni2+脱落且增强对His标签蛋白的结合能力，提高纯化效率。较高的基团密度提高了蛋白载量。该产品在天然或变性条件下，对来源于各种表达系统（如杆状病毒、哺乳细胞、酵母以及细菌）中的His标签蛋白均有很好的纯化效果。本产品已螯合镍离子，可直接使用，方便，快捷。 支持物： CL-6B琼脂糖凝胶 载量： 20-30 mg His标签蛋白/ml填料 粒径： 50-160 μm 【注意事项】 1．缓冲液中不建议使用 β-巯基乙醇、DTT或EDTA。 2．整个纯化过程中切忌凝胶脱水变干。 3．为提高纯化效率，首先确定Binding Buffer和Elution Buffer中咪唑的最佳使用浓度。可以使用线性或梯度浓度的咪唑（20-500 mM）洗脱蛋白，并通过SDS或WesternBlotting来检测目的蛋白的纯度。 4．为避免柱子被堵塞，请使用高纯度的试剂配制缓冲液，并通过0.45 μm过滤器过滤。建议将裂解液进行离心，或者使用0.45 μm过滤器过滤。 5．柱再生时，保证每步洗完后都要用足够的去离子水冲洗至中性。 【操作步骤】 A、缓冲液的准备 1．可溶性蛋白纯化缓冲液配方: 成分 Tris-HCl（PH 7.9） 咪唑 氯化钠 Soluble Binding Buffer 20 mM 10 mM 0.5 M Soluble Elution Buffer 20 mM 500 mM 0.5 M 2. 包涵体蛋白纯化缓冲液配方 成分 Tris-HCl（PH 7.9） 咪唑 氯化钠 尿素/盐酸胍 Inclusion Body Binding Buffer 20 mM 5 mM 0.5 M 8 M/6 M Inclusion Body Elution Buffer 20 mM 500 mM 0.5 M 8 M/6 M B、组装层析柱1．将Ni-Agarose Resin填料混匀后加入层析柱，室温静置10分钟，待凝胶与溶液分层后，把底部的出液口打开，让乙醇通过重力作用缓慢流出。注意：1）填料的上层是乙醇保护层，将填料和乙醇一起混匀，以每ml填料纯化20-30mg His标签蛋白计算，取需要的填料与乙醇的混合液加入层析柱。2）本实验是通过重力作用使溶液流出，如果溶液不流出，可以给柱子一个外力，例如用大拇指对柱口轻轻按压一下，迫使其流出。 2．向装填好的柱中加入5倍柱体积的去离子水将乙醇冲洗干净后，再用10倍柱体积的Binding Buffer平衡柱子，平衡结束后即可上样。注意：柱体积指的是填料的体积。 C、可溶性蛋白的纯化 1．收集菌体，每100 mg菌体（湿重）加入1-5 ml细菌裂解液，超声裂解菌体。10,000×g离心10分钟后，收集上清。 2．将上清液过柱，流速为10倍柱体积/小时。 3．使用15倍柱体积的Soluble Binding Buffer冲洗柱子，收集流穿峰。 4．使用5倍柱体积的Soluble Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰。 5．洗脱后，依次使用3倍柱体积的Soluble Binding Buffer和5倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20%乙醇平衡（乙醇要将填料浸没），封柱后2-8℃保存。 D、包涵体蛋白的纯化 1．收集菌体后，每100 mg菌体（湿重）加入1-5 ml 细菌裂解液，超声裂解菌体。 2．离心，弃上清，将沉淀重悬于Soluble Binding Buffer 中（如有需要，可进行超声波处理，超声前可加入1-5 mM 磷酸酶抑制剂混合物）。 3．重复操作2，直至包涵体清洗干净（呈较洁净的乳白色状）