二实验原理—凝胶层析-生物化学与分子生物学精品课程.PPT

层析技术：是利用混合物中各组分的物理化学性质(分子的形状和大小、分子极性、吸附力、 分子亲和力、分配系数等)的不同，使各组分以不同程度分布在两相中 ，是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术 所有的层析系统都由两个相组成 ： 固定相 ：是固体物质或者是固定于固体物质上的成分（可以为固体、液体） 。 流动相 ：即可以流动的物质，如水和各种溶媒（可以为液体或气体） 凝胶层析，又称为凝胶过滤、分子排阻层析或分子筛层析，是利用生物大分子相对的分子质量差异进行层析分离的方法。凝胶颗粒内部呈网状结构，筛孔直径一致。待分离的物质中，分子量大的分子分子直径大，无法进入凝胶颗粒网状结构的小孔穴内，它会从凝胶颗粒的间隙里通过，因此流出速度快；分子量小的分子会进入凝胶颗粒网状结构的小孔穴中穿行，因此流出速度慢 样品中各组分的流出顺序，可用分配系统Ka来量度 Ka=(Ve-Vo)/Vi Ve：为洗脱体积，表示某一组分从层析柱洗出到最高峰出现时，所需的洗脱液体积 Vo：外体积，为层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积（可以用凝胶干重与湿重之差计算而得到） Vi：内体积，为层析柱内凝胶颗粒内部微孔的体积（用分子量很大的物质实际测量而计算得到） 当某组分的Ka=0时(即Ve=Vo)，说明该组分完全不进入凝胶颗粒微孔，洗脱时最先流出 若某组分的Ka=1(即Ve=Vo+Vi)时，说明该组分可自由地扩散进入凝胶颗粒内部的微孔中，洗脱时，最后流出 Ka在0-1之间的组分，洗脱时Ka值小的先流出 ，Ka值大的后流出。在限定的条件下，Vi和Vo都是恒定值 在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用。当洗脱液的体积等于Vo+Vi时，所有组分都应该被洗脱出来，即Ka的最大值为1。然而在某种情况下Ka值会大于1。这种反常现象说 明这一层析过程不是单纯的凝胶层析，其中可能还夹杂有吸附或离子交换等过程 装柱：凝胶溶胀后，湿法装柱，以柱床均匀、无气泡表面平整为佳 系统平衡：连接各装置，用缓冲液洗涤柱子，并打开检测器，使检测器稳定 上样：分别加标准分子量蛋白质和1ml 血清。 洗脱、记录 结果计算及分析 注意事项 要通过实验合理调整流速、检测器和记录仪的灵敏度，和记录仪的走纸速度，才能获得良好的洗脱曲线 若峰有重叠，宜加长柱子，降低流速 若峰间距离过大，峰过宽，宜缩短柱子，加快流速，降低走纸速度 峰过高，可减少加样量，或降低检测器和记录仪的灵敏度 峰过低则需加大灵敏度，或加大加样量。 * 分子生物学 2008 实验 * 凝胶柱层析分析蛋白质分子量大小 一. 实验目的 掌握凝胶层系的原理、测定蛋白质分子量大小的方法 熟悉并掌握分子实验相关仪器的应用及操作 二. 实验原理 二. 实验原理 名称 分离原理 吸附层析法 固定相是固体吸附剂，组份在吸附剂表面吸附力不同,疏水力或静电引力 分配层析法 各组份在流动相和静止液相（固相）中的分配系数不同，溶解度 离子交换层析法 固定相是离子交换剂，各组份与离子交换剂亲和力不同，离子间结合力 凝胶层析法 固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同，排阻效应 亲和层析法 固定相只能与一种待分离组份专一结合，亲和力 按原理，层析分类 二. 实验原理 — 凝胶层析 二. 实验原理 — 凝胶层析 二. 实验原理 — 凝胶层析 蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关 （Ve为洗脱体积） LogM=k1-k2Ve 先测得几种标准蛋白质的 Ve，并以其分子量对数对 Ve作图得一直线，再测出 待测样品的Ve，查标准曲 线即可确定分子量。 LogM A B C LogM测 V测 柱层析装置(恒流泵 层析柱 收集器 主机 记录仪等5件套) 三. 仪器和试剂 四. 操作步骤