土壤微生物DNA 木聚糖酶基因多样性的研究3 - 土壤学报.PDF

第 43 卷 第 2 期 土 　壤 　学 　报 Vol43 ,No2 2006 年 3 月 ACTA PEDOLOGICA SINICA 　Mar . ,2006 土壤微生物 D NA 木聚糖酶基因多样性的研究 张桂敏 　庄永红 　刘 　婷 　马立新 (湖北大学生命科学学院 ,武汉 　430062) 摘 　要 　　采用国产硅胶 GF ( ) 254 60 型 代替进口 Glass bead 的改良方法抽提土壤微生物 DNA ,然后设计了 一对扩增木聚糖酶基因片段的新简并引物 ,对抽提的土壤微生物 DNA 进行 PCR 扩增 。扩增片段连接 pMD18T 载体 ,转化大肠杆菌 ,重组片段通过酶切进行 RFLP 分析后 ,测序分析得到 10 个木聚糖酶基因片段 。对所得片 段翻译的氨基酸序列进行 BLAST 分析表明有 8 个片段与来自放线菌的木聚糖酶具有较高的同源性 ,2 个与假 单胞菌的木聚糖酶具有较高的同源性 。所得 10 个木聚糖酶片段的氨基酸序列同源性比较显示 ,第 27 个氨基 ( ) 酸均为天冬酰胺 N ,暗示这些来 自土壤微生物 DNA 的基因片段编码耐碱的木聚糖酶 。通过构建系统进化 树 ,发现扩增的木聚糖酶片段之间的相似性均在 70 %以上 。 关键词 　　土壤微生物 DNA ;简并引物 ;木聚糖酶 ;基因多样性 中图分类号 　　S15434 　　　　　文献标识码 　　A 　　土壤是微生物的大本营 ,但土壤中能供实验室 木聚糖酶 ,因此木聚糖酶在土壤碳素循环中同样 占 纯培养的微生物却不到土壤微生物总数的 1 %[ 1] , 有重要的地位 。利用分子技术对木聚糖酶基因的研 大量的微生物无法在实验室条件培养[2 ,3 ] ,这使得 究可以监测土壤微生物这种特异的功能 。但是 , 目 经传统的分离培养 、鉴定菌落研究土壤微生物的方 前尚没有研究土壤微生物木聚糖酶基因多样性 ,监 法难以使人们全面了解和深入研究土壤微生物多样 测土壤微生物功能的报道 。 性 。最近 ,随着分子生物学技术的发展 ,不通过培养 同时 ,木聚糖酶在造纸制浆 、食品、纺织 、饲料 、 微生物而对土壤微生物进行研究已成为可能 ,在抽 能源工业中具有广阔的应用前景[8～10 ] 。但是不同 提土壤微生物DNA 后 ,利用 PCR 技术可以将核糖体 应用领域要求具有不同酶学性质的木聚糖酶 , 因此 DNA 片段扩增和检测[4 ,5 ] 。Landeweert 等对土壤微 开发多样性的木聚糖酶基因资源具有重要的意义 。 生物 DNA 的核糖体 DNA 片段进行 PCR 扩增 ,测序 从土壤微生物中直接克隆木聚糖酶基因可以为木聚 分析研究土壤 中真菌的多样性[6 ] ; 马万里等利用 糖酶基因资源开发拓宽领域 。近年来 ,直接抽提土 PCR 和 TRFLP ( Terminal restriction fragment length 壤微生物 DNA 从中克隆基因已成为可能 ,Cottrell 等 ) polymorphism 法对森林土壤微生物多样性进行了研 通过构建土壤 DNA 的基因组文库 ,底物平板筛选从 究[3 ] 。但是这些方法只能研究土壤微生物的种类 , 75 万个转化子中得到 2 个几丁质酶基因[ 11] ; Henne 不能直观地研究土壤微生物的功能 。