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实时多重PCR探针的选择和引物的设计 - 广东省疾病预防控制中心
实时多重PCR探针的选择和引
物的设计
吴德
广东省疾病预防控制中心
病原微生物检验所
2012年9月
你设计过引物和探针吗?
你设计的引物用来做什么?
几个问题
• PCR的目的:检测,克隆,基因分型.
• PCR的类型:定量PCR,RT-PCR,长片段
PCR.
• 样品材料:基因组DNA,RNA,微小RNA.
• 可能的问题:假基因,SNP,变异 。
一、引物的设计
• 引物的特异性
– 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8
个互补碱基完全同源
• 如何验证引物的特异性
埃博拉: 5`-GAGACAACGGAAGCTAATGC-3`
一、引物的设计
• 避开产物的二级结构区
– 某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二
级结构的影响,选择扩增片段时最好避开二级
结构区域
一、引物的设计
• 长度
– 寡核苷酸引物长度为15~30bp,一般为20~27bp
– 退火温度将超过延伸温度
• G+C含量
– G+C含量一般为40%~60%
– 公式Tm=4 (G+C)+2 (A+T )估计引物的Tm
值
– 两条引物的退火温度相差不超过5℃
– 要避免聚-dC,dG, dA,dT区域
一、引物的设计
• 碱基础随机分布
– 引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有
聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
– 尤其3 ′端不应超过3个连续的G或C。
一、引物的设计
• 引物自身
– 引物自身不应存在互补序列
• 引物自身会折叠成发夹状结构,会因空间位阻而影
响引物与模板的复性结合。
• 自身引物为模板,形成引物二聚体
一、引物的设计
• 引物之间
– 两引物之间不应互
补,尤应避免3 ′
端的互补重叠以防
引物二聚体的形
成。
– 一对引物间不应多
于4个连续碱基的
同源性或互补性。
一、引物的设计
• 引物的3 ′端
– 引物的延伸是从
3 ′端开始的,不
能进行任何修饰
– 3 ′端也不能有形
成任何二级结构
可能,除在特殊
的PCR (AS-
PCR)反应中
– 引物3 ′端不能发
生错配。
引物设计举例
• 步骤
– 获得目标序列
(/ )
– 对获得的序列进行多序列比对(MEGA)
– 挑选目的片段
– 利用引物设计软件进行分析
/bioapps/primer
3_www.cgi#PRIMER_SEQUENCE_INPUT
– 引物的特异性评价
/Blast.cgi
二、简并引物的设计
• 简并引物的概念
– 简并引物是指
代表编码单个
氨基酸所有不
同碱基可能性
的不同序列的
混合物。
二、简并引物的设计
• 简并度
– 5-NAGSGNGCDTTANCABK-3
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