引物和探针设计--PCR和定量PCRpdf.PDF

引物和探针设计 – PCRPCR 目录 1 2 4 7 基本原理 DNADNA 3-DNA3-RNA RNADNARNA DNA PCRRTDNA PCR PCR PCRPCRRT-PCRPCR) DNARNARNA SNP) 1 引物设计的重要因素 3 Primer () 引物长度和专一性 18-3015 PCR 平衡GC含量，避免GC-和AT-富集区域 GC40%60%- dC -dG - - dA-dT-- 退火温度 Tm “2+4” 14ATDNA 2°C GC4°C Tm = 2 °C • (A + T) + 4 °C • (G + C) GC13 - (G + C 16.4) Tm = 64.9 °C + 41 °C • (A + T + G + C) 50 nM50 mM Na+ pH 7.0 “”Na+ C + G 820 + Tm = 100.5 °C + 41 °C • • 16.6 • log10([Na ]) A + C + G + T A + C + G + T “”HS 提示 55°C65°C 2 引物设计的重要因素 避免互补的引物序列 3 3 PCRPCR PCR1 A 5’ ACGGATACCA TGCCTAT G 3’ 5’ ACGGATACCA TGCCTA TG 3’ B 5’ ACTTGCATGTCTAGTCAC 3’ 3’ CAGTGAGTTACATGACTG 5’ 图 1 A B 3’-序列 PCR33G-C- PCR-3G/C 3 针对特殊应用的其他提示 逆转录(RT-PCR) RT-PCR mRNADNA 2 2A DNAPCRmRNA DNA mRNA mRNA-DNA 2B A PCR product Intron 1 Genomic DNA Exon 1 Intro