1143细菌内毒素检查法.doc

1143 细菌内毒素检查法 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供 试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和 显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有 争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。 本试验操作过程应防止微生物和内毒素的污染。 细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU 与1 个内毒素国际单位（IU） 相当。 细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲 裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号 B 和C 溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可 靠性试验。 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于 干扰试验及检查法中编号B 和C 溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、 光度测定法中标准曲线可靠性试验。 细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或 0.005EU/ml（用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。 试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用 干热灭菌法（250℃、30 分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素 检查的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应 选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。 供试品溶液的制备 某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成 供试品溶液。必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH 值，一般供试品溶 液和鲎试剂混合后溶液的pH 值在6.0～8.0 的范围内为宜，可使用适宜的酸、 碱溶液或缓冲液调节pH 值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒 素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。 内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下 公式确定： L=K/M 式中 L 为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg 或EU/U（活性单 位）表示； K 为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表 示，注射剂K=5EU/（kg·h），放射性药品注射剂K=2.5EU/（kg·h）， 鞘内用注射剂K=0.2EU/（kg·h）； M 为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以 ml（/ kg·h）、mg（/ kg·h） 或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg 计算，人体表面积按1.62m2 计算。注射时间若不足1 小时，按1 小时计算。供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027 即可转换为每千克体重剂量（M）。 按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做 必要调整，但需说明理由。 确定最大有效稀释倍数（MVD） 最大有效稀释倍数是指在试验中供试品 溶液被允许达到稀释的最大倍数（MVD），在不超过此稀释倍数的浓度下进行内 毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD：MVD=cL/λ 式中 L 为供试品的细菌内毒素限值； c 为供试品溶液的浓度，当L 以EU/ml 表示时，则c 等于1.0ml/ml，当L 以EU/mg 或EU/U 表示时，c 的单位需为mg/ml 或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD 取1，可计算供试品的最小有效稀释浓 度c=λ/L； λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），或是在光度测定法中所使 用的标准曲线上最低的内毒素浓度。 方法1 凝胶法 凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素 的方法。 鲎试剂灵敏度复核试验 在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内 毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml 表示。当使用新批号的鲎 试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素 工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15 分钟，然后制 成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋 涡混合器上混匀30 秒钟。取分装有0.1ml 鲎试剂溶液的10mm×75mm 试管或 复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18 支，其中16 管分别加入0.1ml 不同 浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4 管；另外2 管加入0.1ml 细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直 放入37℃±1℃的恒温器中，保温60 分钟±2 分钟。将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从