2016上海交通大学遗传学实验实验七细菌转导.ppt

实验顺序：先做后讲，因为中间需要等待2小时 分组方案： 2人制备λ噬菌体裂解液 2人涂受体菌平板和点加λ噬菌体 实验七、细菌的局限性转导 五、实验步骤 （一） 噬菌体裂解液的制备（制备λdgal＋） 5ml供体菌 3000 rpm 10 min （多组） 吸去上清 4mlPB重悬 防止污染！ 重悬液 取2ml 打开盖，UV 15S 加2ml 2LB 轻摇混匀 盖上盖，37℃避光 （抑制光修复） 1-N：张三 李四 王五 赵六 1. 按右图在EMB平板上做好标记 2. 用受体菌涂出两条菌带（1-2环菌/条） 3. 37℃倒置培养1.5小时 （二）转导（点滴法）的步骤 实验七、细菌的局限性转导 一、实验目的 （一）了解转导的基本原理 （二） 掌握转导实验的基本方法 （三）验证细菌遗传物质可以通过噬菌体转移 二、实验原理 (一）转导的概念：转导是以噬菌体为媒介所进行的细菌遗传物质的重组过程。在这一过程中，细菌的一段染色体被错误地包装在噬菌体的蛋白质外壳内，并通过感染而转移到到另一个受体细菌内 Joshua Lederberg (1925-2008) 1958年获诺贝尔奖 （二）转导的发现 由Lederberg和Zinder于1952年发现 鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium） 的两种营养缺陷型 LA2: phe+trp+tyr+his- LA22: phe-trp-tyr-his+ 基本培养基 基本培养基 单独培养 基本培养基 LA22 + LA2 混合培养 LA2: phe+trp+tyr+his- LA22: phe-trp-tyr-his+ LA22 LA2 FA? U形管培养 LA2: phe+trp+tyr+his- LA22: phe-trp-tyr-his+ 吹/吸 LA22菌株上清液 基本培养基 + RNA酶 + LA2菌株 + DNA酶 + LA2菌株 基本培养基 噬菌体介导的遗传物质转移 转导 菌落裂解？ P22 发生机理 “We werent looking for transduction--we bumped into it”. (三）转导的类型 P22噬菌体 λ噬菌体 1. 普遍性转导可以转导细菌染色体组的任何部分，例如P22噬菌体介导的转导 2. 局限性转导只能转导细菌染色体组的特定部分，例如λ噬菌体介导的转导 A B B B A 转导噬菌体 普遍性转导可以转导细菌染色体组的任何部分 （例如：P22噬菌体） A基因组的任何部分都可能通过转导噬菌体进入B基因组 细菌染色体 λ (dgal+) λ (dbio+) λ原噬菌体 局限性转导只能转导细菌染色体组的特定部分 （例如:λ噬菌体只能插到宿主基因组的gal和bio之间，所以只能转移gal或bio基因） 噬菌体 由外壳蛋白和DNA组成 基因组DNA全长48.5kb 至少有61个基因 头部的包装上限为51kb （四）本实验的原理 5’ GGGCGGCGACCT CCCGCCGCTGGA 5’ 3’ 3’ cos cos cos 环化 λ噬菌体DNA的环化 A D C B λ噬菌体DNA插入大肠杆菌基因组 A D C B 溶源性细菌 原噬菌体 细菌基因组DNA gal + 插入宿主菌基因组的原噬菌体随宿主菌的分裂而增殖，当受到紫外线照射或温度改变时可以造成阻遏物失活，使裂解相关基因表达，噬菌体DNA环出、复制、转录、翻译、包装，细菌裂解，释放出数百个新噬菌体 环出、复制、转录、翻译、包装 裂解 释放子代噬菌体 在环出、复制、包装过程中偶尔会发生错误而产生转导噬菌体（频率≈10-6) 转导噬菌体能感染宿主菌，但由于DNA缺失，不能独立完成复制、包装等过程，所以是缺陷噬菌体 溶菌控制 晚期控制 DNA合成控制 阻遏 早期控制 重组 删除与整合 尾部合成 头部合成 λ噬菌体基因组DNA各部分的功能 λ (dgal+) E. coli K12S gal－ E. coli K12S gal－ 受体菌 受体菌 λ 半乳糖EMB培养基 通过转导噬菌体获得gal+基因的受体菌称为转导子 转导子因能利用半乳糖而产生大量的酸，在EMB培养基上显示为紫色,并带有金属光泽 gal+ 转导子 gal - 非转导子 非转导子因不能利用半乳糖而不产生大量酸，在EMB培养基上显示为白色 E. coli K12(λ) gal+是一种双重溶源菌 λ(dgal+) λ 裂解液中 ?(dgal+) (转导噬菌体)占50% (正常噬菌体)占50% 宿主菌染色体 本实验所用的供体菌 三、实验材料 供体菌：E. coli K12(λ)gal+ 受体菌：E. coli K12S