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人凋亡信号调节激酶I（ASK-1）酶联免疫分析试剂盒 使用说明书 本试剂盒仅供体外研究使用! 预期应用 ELISA 法定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中ASK-1 含量。 实验原理 用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗ASK-1 抗体的微孔中依次加入标本或 标准品、生物素化的抗ASK-1 抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB 显 色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的 深浅和样品中的ASK-1 呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算 样品浓度。 试剂盒组成及试剂配制 1.酶联板：一块（96 孔） 2.标准品（冻干品）： 2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10 分钟以 上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为10 ng/ml，做系列倍比稀释（注：不要直接在 板中进行倍比稀释）后，分别稀释成10 ng/ml，5ng/ml，2.5ng/ml，1.25 ng/ml，0.625 ng/ml，0.312 ng/ml，0.156ng/ml，样品稀释液直接作为标准浓度 0ng/ml，临用前15 分钟内配制。如配制 5 ng/ml 标准品：取0.5ml （不要少于0.5ml ） 10 ng/ml 的上述标准品加入含有0.5ml 样品 稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。 3.样品稀释液：1×20ml。 4.检测稀释液A：1×10ml。 5.检测稀释液B：1×10ml。 6.检测溶液A：1×120μl（1:100）临用前以检测稀释液A 1:100 稀释，稀释前根据预先计算 好的每次实验所需的总量配制（100μl/孔），实际配制时应多配制 0.1-0.2ml。如10μl 检测 溶液A 加990μl 检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。 7.检测溶液B：1×120μl/瓶（1:100）临用前以检测稀释液B1:100 稀释。稀释方法同检测溶 液A。 8.底物溶液：1×10ml/瓶。 9.浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 10. 终止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。 11. 覆膜：5 张 12. 使用说明书：1 份 自备物品 1. 酶标仪（建议参考仪器使用说明提前预热） 2. 微量加液器及吸头，EP 管 3. 蒸馏水或去离子水，全新滤纸 标本的采集及保存 1.血清：全血标本请于室温放置2 小时或4℃过夜后于1000 x g 离心20 分钟，取上清即可 检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。 2.血浆：可用EDTA 或肝素作为抗凝剂，标本采集后30 分钟内于2 -8° C1000 x g离心15 分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。 3.其它生物标本：请1000 x g 离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃ 保存，但应避免反复冻融。 4.样本处理：血清或血浆标本推荐稀释10倍，如：稀释 10倍，取100uL血清或血浆加入900uL 样品稀释液。标本使用0.1 M 的PBS稀释（PH=7.0-7.2）。 注：以上标本置4℃保存应小于1周，-20℃或-80℃均应密封保存，-20℃不应超过1 个月，-80 ℃不应超过2 个月；标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。 操作步骤 实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37℃溶解）；试 剂或样品稀释时， 均需混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进 行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。 1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液 100μl，余孔分别加标 准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁， 轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120 分钟。为保证实验结果有效性，每次实 验请使用新的标准品溶液。 2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加 检测溶液A 工作液 100μ（l 在使用前一小时内配制 ）， 酶标板加上覆膜,37℃反应60分钟。 3.温育60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板 3 次，每次浸泡1-2 分钟，大约400μl/每孔， 甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。 4.每孔加检测溶液B工作液（同检测A 工作液）100μl，酶标板加上覆膜37℃反应60 分钟。 5.温育60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5 次，每次