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人凋亡信号调节激酶.pdf

人凋亡信号调节激酶I(ASK-1)酶联免疫分析试剂盒 使用说明书 本试剂盒仅供体外研究使用! 预期应用 ELISA 法定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中ASK-1 含量。 实验原理 用纯化的抗体包被微孔板,制成固相载体,往包被抗ASK-1 抗体的微孔中依次加入标本或 标准品、生物素化的抗ASK-1 抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB 显 色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的 深浅和样品中的ASK-1 呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值),计算 样品浓度。 试剂盒组成及试剂配制 1.酶联板:一块(96 孔) 2.标准品(冻干品): 2瓶,每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml,盖好后静置10 分钟以 上,然后反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为10 ng/ml,做系列倍比稀释(注:不要直接在 板中进行倍比稀释)后,分别稀释成10 ng/ml,5ng/ml,2.5ng/ml,1.25 ng/ml,0.625 ng/ml,0.312 ng/ml,0.156ng/ml,样品稀释液直接作为标准浓度 0ng/ml,临用前15 分钟内配制。如配制 5 ng/ml 标准品:取0.5ml (不要少于0.5ml ) 10 ng/ml 的上述标准品加入含有0.5ml 样品 稀释液的Eppendorf管中,混匀即可,其余浓度以此类推。 3.样品稀释液:1×20ml。 4.检测稀释液A:1×10ml。 5.检测稀释液B:1×10ml。 6.检测溶液A:1×120μl(1:100)临用前以检测稀释液A 1:100 稀释,稀释前根据预先计算 好的每次实验所需的总量配制(100μl/孔),实际配制时应多配制 0.1-0.2ml。如10μl 检测 溶液A 加990μl 检测稀释液A的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。 7.检测溶液B:1×120μl/瓶(1:100)临用前以检测稀释液B1:100 稀释。稀释方法同检测溶 液A。 8.底物溶液:1×10ml/瓶。 9.浓洗涤液:1×30ml/瓶,使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 10. 终止液:1×10ml/瓶(2N H2SO4)。 11. 覆膜:5 张 12. 使用说明书:1 份 自备物品 1. 酶标仪(建议参考仪器使用说明提前预热) 2. 微量加液器及吸头,EP 管 3. 蒸馏水或去离子水,全新滤纸 标本的采集及保存 1.血清:全血标本请于室温放置2 小时或4℃过夜后于1000 x g 离心20 分钟,取上清即可 检测,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。 2.血浆:可用EDTA 或肝素作为抗凝剂,标本采集后30 分钟内于2 -8° C1000 x g离心15 分钟,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。 3.其它生物标本:请1000 x g 离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃或-80℃ 保存,但应避免反复冻融。 4.样本处理:血清或血浆标本推荐稀释10倍,如:稀释 10倍,取100uL血清或血浆加入900uL 样品稀释液。标本使用0.1 M 的PBS稀释(PH=7.0-7.2)。 注:以上标本置4℃保存应小于1周,-20℃或-80℃均应密封保存,-20℃不应超过1 个月,-80 ℃不应超过2 个月;标本溶血会影响最后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。 操作步骤 实验开始前,各试剂均应平衡至室温(试剂不能直接在37℃溶解);试 剂或样品稀释时, 均需混匀,混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量,如样品浓度过高时,应对样品进 行稀释,以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围,计算时再乘以相应的稀释倍数。 1.加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液 100μl,余孔分别加标 准品或待测样品100μl,注意不要有气泡,加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁, 轻轻晃动混匀,酶标板加上盖或覆膜,37℃反应120 分钟。为保证实验结果有效性,每次实 验请使用新的标准品溶液。 2.弃去液体,甩干,不用洗涤。每孔加 检测溶液A 工作液 100μ(l 在使用前一小时内配制 ), 酶标板加上覆膜,37℃反应60分钟。 3.温育60 分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板 3 次,每次浸泡1-2 分钟,大约400μl/每孔, 甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。 4.每孔加检测溶液B工作液(同检测A 工作液)100μl,酶标板加上覆膜37℃反应60 分钟。 5.温育60 分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板5 次,每次

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