蛋白纯化系统Model 491 操作简介.DOCVIP

M-491操作简介 一.所需试剂 1 Prepare 30% T/2.67% C acrylamide monomer stock solution (100 ml) 2 - 1.5M Tris/HCl, pH 8.8 (100 ml) 3 0.5M Tris/HCl, pH 6.8 (100 ml) 4 Tris/Glycine/SDS (10 liters) Dilute 1 liter of 10x 5 10%胶 20ml 30% T/2.67% C stock solution 6.67 ml 1.5 M Tris/HCl, pH 8.8 5.0 ml Distilled water 8.27 ml 10 % ammonium persulfate 50 μl* TEMED 5 μl* TOTAL MONOMER 20 ml 6 4%胶 2ml 30% T/2.67% C stock solution 1.33 ml 0.5 M Tris/HCl, pH 6.8 2.5 ml Distilled water 6.1 ml 10 % ammonium persulfate 50 μl* TEMED 10 μl* TOTAL MONOMER 10 ml 7 水饱和正丁醇 8 样品：标准品300uL 二.工作条件:Recommended running conditions and expected results: Model 491 Prep Cell Power conditions: 40 mA constant o 10–12 W constant Elution flow rate: 1 ml/min Cooling flow rate: 80-100 ml/min Fraction collector: 2.5 ml/fraction 三.操作过程: A湿润膜:须将图中的膜在收集液中湿润过夜. B 安装灌胶底座，调节水平，插入冷却芯，并灌胶(10%的分离胶) 1 2 3 4 C 胶面加水饱和正丁醇,1Hour后,去水饱和正丁醇,用去离子水冲洗胶面，再加4%沉积胶;加水饱和正丁醇压1Hour D 启胶,安装滤膜底座. 12 3 E安装上槽 D安装下槽 F上槽缓冲液600ml,洗脱液750ml,必须去掉洗脱液中和管道中的气泡.下槽缓冲液须高过胶面2 cm G 电泳液的冷却循环,在电泳仪外须设制一冷却冰浴并确保不会泄漏 F样品加样:须小心的用注射器,穿过上槽缓冲液的液面,将样品加到胶面. H启动电源,并接通自动部分收集器和UV 1ml/min, 2.5ml/fraction G实验完成后，须进行实验装置清洗。滤膜和滤板须保存在去离子水中。 实验结果如下图：（实际上可以看见3个峰） 用M491系统和非变性胶分离纯化蛋白质，需先用小胶和少量蛋白质进行预实验。在纯化分离蛋白质前，建议先根据说明书所推荐一系列方法对新的目标蛋白质进行一系列的预实验。任何优化好的纯化方法，须将少量样品在M491上进行预实验。图1给出了蛋白纯化优化程序的概貌。